雷帕霉素抑制JAKSTAT通路对急性肝损伤大鼠肝组织HMGB

@wjgnet.com世界华人消化杂志2006年7月8日;14(19):1916-1920ISSN1009-3079CN14-1260/R研究快报RAPIDCOMMUNICATION雷帕霉素抑制JAK/STAT通路对急性肝损伤大鼠肝组织HMGB1表达的影响张芸,赵中夫,韩德五,王锋,许瑞龄,刘明社张芸,赵中夫,刘明社,山西长治医学院肝病研究所山西省长治市046000韩德五,王锋,许瑞龄,山西医科大学肝病研究所山西省太原市030001通讯作者:赵中夫,046000,山西省长治市解放东街161号,长治医学院肝病研究所[e-mail]电话:[phone]传真:[phone]收稿日期:2006-03-20接受日期:2006-05-08Rapamycin-inducedinhibitionofJanuskinase/signaltransducerandactivatoroftranscriptionpathwayaffectsexpressionofhigh-mobilitygroupbox1inratswithacuteliverinjuryYunZhang,Zhong-FuZhao,De-WuHan,FengWang,Rei-LingXu,Ming-SheLiuYunZhang,Zhong-FuZhao,Ming-SheLiu,InstituteofHepatology,ChangzhiMedicalCollege,Changzhi046000,ShanxiProvince,ChinaDe-WuHan,FengWang,Rei-LingXu,InstituteofHepa-tology,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,ShanxiProvince,ChinaCorrespondenceto:ProfessorZhong-FuZhao,InstituteofHepatology,ChangzhiMedicalCollege,161JiefangEastRoad,Changzhi046000,ShanxiProvince,[e-mail]:2006-03-20Accepted:2006-05-08AbstractAIM:Toinvestigatetheeffectofrapamycin(RPM)ontheexpressionofhigh-mobilitygroupbox1(HMGB1)inratswithacuteliverinjury(ALI)byinhibitingJanuskinase/signaltransducerandactivatoroftranscriptionpathway.METHODS:Wistarratswererandomlydividedintonormalcontrolgroup(n=30),ALIgroup(n=30)andRPMtreatmentgroup(n=30).ALIwasinducedbyintraperitonealadministrationofD-Galactosamine/lipopolysaccharide(D-Galn/LPS).Theanimalsineachgroupweresacrificedatdifferenttimepointstocollectthebloodandhepatictissuesamplesforthedetec-tionofalanineaminotransferase(ALT)levelandHMGB1expression,respectively.RESULTS:Incomparisonwiththatinthenor-malcontrols(1.00±0.02),HMGB1expressionwassignificantlyincreasedinlivertissues24,48and72hafterALI(3.12±0.06,3.9±0.08,2.83±0.04,respectively,t=16.01,3.86,10.46,allP0.01),andserumALTlevelsweremarkedlyelevated.TheexpressionofHMGB1inlivertis-sueswasdramaticallyinhibited24,48and72hafterRPMtreatmentascomparedwiththatinALIgroup(1.67±0.05vs3.12±0.06;1.93±0.06vs3.9±0.08;1.47±0.04vs2.83±0.04;t=20.11,41.90,26.02,allP0.01).Inaddition,serumALTlevelswerealsomarkedlyreducedduring24-72hafterRPMtreatment(P0.01).HMGB1expressionwaspositivelycorrelatedwithALTlevel(r=0.741,P0.01).CONCLUSION:TheactivationofJAK/STATpathwaymaybeinvolvedintheup-regulationofHMGB1expressioninALI.RPMtreatmentcanmarkedlydown-regulatesHMGB1expres-sionandattenuatesALI.KeyWords:High-mobilitygroupbox1;JAK/STAT;AcuteLiverInjury;RapamycinZhangY,ZhaoZF,HanDW,WangF,XuRL,LiuMS.Rapamycin-inducedinhibitionofJanuskinase/signaltransducerandactivatoroftranscriptionpathwayaffectsexpressionofhigh-mobilitygroupbox1inratswithacuteliverinjury.ShijieHuarenXiaohuaZazhi2006;14(19):1916-1920摘要目的:探讨雷帕霉素抑制JAK/STAT通路对急性肝损伤大鼠肝组织HMGB1表达的影响.方法:采用D-Galn/LPS复制急性肝损伤(ALI)模型.大鼠随机分为正常对照组(n=30)、ALI组(n=30)、STAT抑制剂雷帕霉素(RPM)处理组(n=30).用Westernblot方法测定肝组织HMGB1蛋白,全自动生化分析仪测定肝功能®■背景资料近年的研究发现,内毒素和细胞因子等刺激巨噬细胞时,HMGB1这种能对DNA重组、修复、复制和基因转录起重要作用的核内结构蛋白会被释放到胞外,介导炎症反应.JAK/STAT通路是多种细胞因子发挥作用的重要信号通路.HMGB1是否通过JAK/STAT通路参与急性肝损伤病理过程目前尚不完全清楚.张芸,等.雷帕霉素抑制JAK/STAT通路对急性肝损伤大鼠肝组织HMGB1表达的影响1917指标.结果:与正常对照组HMGB1表达水平(1.00±0.02)相比,ALI组24-72hHMGB1表达显著升高(3.12±0.06,3.9±0.08,2.83±0.04,t值分别为16.01,3.86,10.46,均P0.01),血清丙氨酸转氨酶(ALT)6和24h有两个峰值,且24h峰值高于6h.与ALI组相比,RPM预处理组24-72hHMGB1蛋白表达均显著抑制(1.67±0.05vs3.12±0.06;1.93±0.06vs3.9±0.08;1.47±0.04vs2.83±0.04;t值分别为20.11,41.90,26.02,均P0.01),ALT在24,48,72h也均有不同程度下降(P0.01).ALT与HMGB1呈正相关(r=0.741,P0.01).结论:抑制JAK/STAT可明显下调肝组织中HMGB1蛋白表达,并有助于减轻D-Galn/LPS所致的急性肝损伤.关键词:高迁移率族蛋白B1;JAK/STAT;急性肝损伤;雷帕霉素张芸,赵中夫,韩德五,王锋,许瑞龄,刘明社.雷帕霉素抑制JAK/STAT通路对急性肝损伤大鼠肝组织HMGB1表达的影响.世界华人消化杂志2006;14(19):1916-1920引言高迁移率族蛋白B1(HMGB1)细胞外释放可作为炎症介质参与炎症反应和组织损伤过程[1-4].研究表明,虽然HMGB1与多种细胞膜上的RAGE受体有较高的亲和力[5],但也可以通过TLR2,TLR4等受体通路参与对炎症因子转录和表达[6-7].Lietal[8]与Wangetal[9]发现,在严重烧伤、烫伤后并发金黄色葡萄球菌感染和腹腔感染所致的大鼠肝脏等器官损伤时,HMGB1可以在转录水平上上调.并证明了Janus激酶/信号转导和转录激活因子(JAK/STAT)通路与肝组织HMGB1mRNA上调有关.Tsungetal[10]在研究肝组织缺血/再灌注时发现肝组织HMGB1表达增强,但原发性肝损伤动物HMGB1蛋白表达水平及JAK/STAT通路的作用尚不清楚.我们观察D-Galn/LPS介导的大鼠急性肝损伤时,HMGB1在蛋白表达水平的变化以及JAK/STAT抑制剂——雷帕霉素(RPM)对HMGB1表达和肝损伤的影响.1材料和方法1.1材料雌雄各半的清洁级Wistar大鼠90只,180-220g(山西医科大学动物实验中心提供),随机分为3组:(1)急性肝损伤组(ALI组,n=30):动物在禁食12h后同时ip700mg/kgD-氨基半乳糖(重庆医科大学生物化学工程学院)和5μg/kg内毒素(Sigma公司);(2)STAT3抑制剂——雷帕霉素(天津新美科技开发有限公司)干预组(RPM组,n=30):于建模前1hsc雷帕霉素溶液0.6mg/kg(1mL);(3)正常组(N组,n=30):在相应建模时间点ip等量生理盐水.各组动物分别于3,6,12,24,48,72h随机取5只动物,10g/L的戊巴比妥钠麻醉后,腹主动脉采血,加入抑肽酶1mU/L,离心将血清分装保存-70℃待检测,并留取肝组织.一部分肝组织用40g/L甲醛固定做HE染色,另一部分冻存在-70℃用于肝组织HMGB1的检测.1.2方法1.2.1肝组织HMGB1含量检测Westernblot检测按参考文献[11]操作,称取各时间点的肝组织100mg,于全细胞裂解液中匀浆,超声处理提取肝组织中的总蛋白,并测定蛋白浓度,每个样品取50mg蛋白以2×上样缓冲液煮沸5min.将样品以120g/L的聚丙烯酰胺凝胶电泳,并电转移至硝酸纤维素膜上.50g/L脱脂奶粉封闭过夜后,加入1∶1000稀释的小鼠抗人HMGB1mAb(英国Abcam公司),4℃过夜,TBS洗膜后,加入1∶1000稀释的碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠抗体(美国Sigma公司),室温孵育2h,TBS洗膜后,BCIP/NBT显色.Mr30000处显色条带强弱,用Image-ProPlus5.0凝胶成像分析系统半定量分析,以显色条带总光密度值(integratedopticaldensity,IOD)表示HMGB1含量.1.2.2肝组织病理检查和血浆ALT测定使用7170自动生化分析仪测定各实验组血清丙氨酸转氨酶(ALT)水平.将组织于40g/L甲醛固定,石蜡包埋,5μm切片,HE染色,光镜下观察组织形态学变化.统计学处理采用SPSS13.0软件包分析,所有实验数据均采用mean±SD表示,P0.05为差异有显著性.2结果2.1肝组织病理学变化正常动物肝组织HE染色显示肝小叶结构完整,无肝细胞变性坏死.ALI组:6h后有炎细胞浸润和