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50430api50CHB培养基供体外诊断用芽孢杆菌属(Bacillus)原理API50CHB培养基是用来研究芽孢杆菌的49种糖API50CH试验条的发酵作用的一种快速简便的培养基，用被测的微生物在培养基中制成菌悬液，接种试验条的每一个管。培养期间，糖发酵产酸，致使pH下降，以指示剂的颜色变化予以表示。结果组成该菌株的生化图谱，并用它来鉴定或分型。有时，所得的结果就能鉴定;有的情况，还需要观察形态。API20E的结果用于芽孢杆菌(Bacillus)还需用bioMerieux软件。试剂一套(能测10次)包括：-10个API50CHB培养基安瓿-1份说明书附加产品(不包括一套中)：-API50CH试验条(ref.50300)-API20E试验条(ref.20100)-API20E试剂(ref.20120)-0.85%NaCl基物5ml(ref.20230)-无菌生理盐水，1ml-McFarland标准2.(ref.70900)光密度计：DENSIMAT(ref.99234)或ATB光密度计-鉴定软件(bioMerieux有)-吸管或PSI吸管(ref.70250)-矿物油(ref.70100)-安瓿管架(ref.70200)-无菌棉签(ref.70610)必备实验室设备-培养箱(20-300C,-37-550C)；-冰箱-本生煤气灯-记号笔培养基的成份API50CHB培养基10ml(NH4)2SO42g酵母膏0.5g胰蛋白胨1g酚红0.18g无机盐基础(Cohen-Bazire)10ml磷酸缓冲液pH7.81000mlNaCl0.85%培养基5mlNaCl8.5g无离子水1000mlAPI20E试剂：见API20E说明书。培养基贮存在有效日期(在包装上标出)内培养基应贮存于2-8°C。警告与注意事项仅供体外诊断用。合格试验室检验人员应无菌操作，并防止带传染物。不能用口吸标本或试剂。不使用过期试剂。使用前，将试剂从冰箱中取出，使其达室温(20-30°C)。小心启开安瓿瓶。-用手垂直握住安瓿瓶(白色瓶盖朝上)。-尽量将瓶盖压下-用大姆指顶住瓶盖上斜面部分。-向外加压，使瓶盖内瓶断裂*无滴头的安瓿-小心取开瓶盖*有滴头的安瓿瓶-垂直倒置安瓿-挤压瓶盖，将所有试剂倒入滴瓶所有接过接种的试验条应视为带传染性，作适当处置。1所有患者标本和微生物培养物都是潜在的传染物，应按推荐的注意事项(NCCLSM29-T2：CDCmanualBiosafetyinMicrobiologicalandBiomedicalLaboratores,1993)..完成测试、读和判断结果后，所有标本和接种过的试验条在丢弃之前，都需经高压灭菌、烧烬或浸泡杀菌剂中。试验结果的判断应由合格的微生物家所作，同时应将病史、标本来源、菌落和显微形态考虑在内，如有可能，再作一些附加试验，尤其是抗生素敏感谱。使用说明标本和细菌培养物应视为传染物，应由训练有素的合格检验师才能作适当的处置。无菌技术和对该研究菌群的操作，都应根据以下进行：”NCCLSM29-T2,ProtectionofLaboratoryWorkersfrominfectiousDiseasesTransmittedbyBlood,BodyFluids,andTissue2ndEdition;TentativeGuidelines).附加操作注意点，参照微生物和生物医学试验室生物安全手册，HHSpuldicationNo.(CDC)93-8395,3rdEdition(May,1993),或本地规定。菌落选择检查菌株的纯度。检查菌株属于芽孢杆菌属(Bacillus)：好氧的生芽孢的杆菌，通常是G+反应，(译者注一应包括兼性厌氧；G一也是不少见的)。培养菌株于营养琼脂平板上。对生长缓慢的菌株，应该用二个平板，以至有足够的菌量使用。培养菌株：-中温菌于250C和450C培养16-18小时；-低温菌于200C培养48小时；-高温菌于550C培养12-16小时。如果对测定菌不知最适生长温度，则需几套平板培养于不同温度下。试验条的准备见API50CH和API20E说明书。接种准备如用光密度计：-按“警告和注意事项”(无滴头安瓿)所示，打开API50CHB培养基。-挑取几个一致菌落，得到在API50CHB培养安瓿中制备菌悬液，浊度相当于2McFarland。用该安瓿接种API50CH试验条。-按“警告和注意事项”(无滴头安瓿)所示，打开0.85%NaCl培养基(5ml)安瓿，挑取几个一致的菌落，制备浊度相当于2McFarland的菌悬液。该安瓿用于接种API20E试验条。如不用光密度计:-打开一个含有1ml无菌生理盐水的管。-用无菌棉签挑取培养物上所有的细菌在管中制成浓的菌悬液(S)。-按“警告和注意事项”(无滴头安瓿)所示，打开0.85%NaCl(5ml)安瓿，加入几滴菌液(S)制备浊度相当于2McFarland的菌悬液。记录加入的滴数(n)。含细菌悬液2McFarland的0.85%NaCl(5ml)安瓿用于接种API20E试验条。-按“警告和注意事项”(无滴头安瓿)所示，打开API50CHB培养基的安瓿。-加2倍该菌液(即2n)接种API50CHB培养基安瓿。均匀。注：API20E试验条也用：-根据API20E说明书所示的接种说明，在0.85%NaCl安瓿中，调菌悬液至2McFarland浊度。-只接种前12个测定，因为后面8个测定与API50CH试验条是重复的。试验条的接种用巳接种的API50CHB培养基加入验条的管(不加杯)。加矿物油，不强制性但推荐使用，为了便于在阳性和阴牲的判断时颜色的观察。培养：中温菌在300C或370C培养48小时。低温菌在200C培养96小时高温菌在550C培养24小时。API50CH试验条，管底不要过高，防止盘内产气泡。2如果最适温度不详，则培养在中温情况。注：API20E试验条也是相同的培养操作。读试验条(见API50CH说明书)读二次结果：-中温菌在培养24和48小时后。-低温菌在培养48和96小时-高温菌在培养24小时后。对生长快的高温菌必需培养3或6小时培养后读，有时在2小时后结果不好解释。阳性：酸化由于培养基所含酚红变黄而呈现；七叶灵测定(第25号管)由红色变黑色。偶尔，阳性结果在第二次读时变为阴性。这是因为从蛋白胨产氨中和所产的酸所致。这些结果应记录为阳性。在报告单上记录结果。对API20E试验条，在最后读结果后加入试剂。读测定结果。参照API20E说明书。前11个测定结果和在葡萄糖测定中的NIT反应的结果记录最后的解释。3形态试验：-研究细胞大小和营养体形态和孢囊，菌应培养在含特殊培养基，例FINEY和FIELDS培养基的平板上：营养琼脂15g琼脂5g葡萄糖0.5gMnSO4H2O0.030g蒸馏水1000mlpH=7-菌培养于：-中温菌在30°C培养12-16小时。-低温菌在20°C培养24-36小时。-高温菌在55°C培养4-6小时。-少许生长物涂在一滴生理盐水于玻片上，盖上盖玻片，用相差显微镜观察(如果没有相差显微镜，则可用单染和芽孢染色法)。观察以下特征：-杆状是否常出现呈二个以上细胞的链状。-细胞运动性：以年幼培养物的细胞证实。(30°C，6小时；20°C，12-24小时；37°C，5小时；55°C，2-4小时)，应挑琼脂斜面底部液体中的生长物。-菌的细胞质中有无气泡。-芽孢有无：如没有，再继续培养24小时后再观察。-芽孢形状：术语见图示；卵形芽孢被记录成园和椭园二种，肾状芽孢为椭园形的；香蕉形芽孢为柱状，它们之间的过渡类型也有的。-芽孢位置和孢囊膨大：术语见图示如下。在同一个培养物中可见到几种不同的位置，孢囊的膨大也可变的，但只在表现明显时记录为阳性(每组的左面为孢囊膨大型一译者注)-伴孢体和晶体。伴孢体常常出现在侧孢芽孢杆菌(B.laterosporus)，并与芽孢的特征性的侧生位置有关。晶体见于苏云金芽孢杆菌(B.Thuringiensis)。有些血清型，在一个细胞可形成多于一个的晶体。晶体形状是不同的，有菱形到不规则的钻石形。-细胞宽度：为了区分出细胞宽度大于或小于1μ，则观察时应该使用成像接目镜或接目反射镜(译注一可用测微尺)。结果的解释菌株所得的生化图谱能做：-用鉴定软件鉴定；4-根据记录，可鉴别菌株，并作菌株间的比较；-与其它图谱进行该群细菌的分类研究。废物处理所有安瓿、吸管、试验条和培养盒使用后，在处理之前必需高压灭菌、焚烧或浸于杀菌剂。推荐迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)的生长会被加入1g脲素/1立升营养琼脂(在高压灭菌后)而促进。质量控制培养基、试验条和试剂在有效期内不同阶段需作系统的质量控制，，对自愿作质控者，推荐以下培养物：多粘芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)ATCC43865ATCC：AmericanTypeCultureCollection,12301ParklawnDrive,Rockville,Maryland20852,USA.5试验条的成份试验条0-9管/底物试验10-19管/底物试验条20-29管/底物试验条30-39管/底物试验条40-49管/底物0对照1甘油2赤癣醇3D-阿拉伯糖4L-阿拉伯糖5核糖6D-木糖7L-木糖8阿东醇9β-甲基-D-木糖甙10半乳糖11葡萄糖12果糖13甘露糖14山梨糖15鼠李糖16卫茅醇17肌醇18甘露醇19山梨醇20α-甲基-D-甘露糖甙21α-甲基-D-葡萄糖甙22N-乙酰-葡糖胺23苦杏仁甙24熊果甙25七叶灵26柳醇27纤维二糖28麦芽糖29乳糖30蜜二糖31蔗糖32海藻糖33菊糖34松叁糖35棉子糖36淀粉37肝糖38木糖醇39龙胆二糖40D-松二糖41D-来苏糖42D-塔格糖43D-岩糖44L-岩糖45D-阿拉伯糖醇46L-阿拉伯糖醇47葡萄糖酸盐482-酮基-葡萄糖酸盐495-酮基-葡萄糖酸盐参考文献6