ELISA法检测鼠肿瘤坏死因子α的改进和应用

-508-ChineseJournalofthePracticalChinesewithModernMedicine2007VOL.(20)NO.6ELISA法检测鼠肿瘤坏死因子α的改进和应用ModificationandapplicationofELISAfordetectionofMurineTNF-α代方国1赵晓山2（1.中国人民解放军军事医学科学院二所，北京，100850；2.广州中医药大学附属第二临床医学院，广东广州，510105）DaiFang-guo1ZhaoXiao-shan2(1.InstituteofRadiationMedicineoftheacademyofmilitarymedicalsciences1,Beijing100850;2.Departmentofinternalmedicinetwo,SecondHospitalofGuangzhouUniversityofChineseMedicine510105)中图分类号：R73文献标识码：A文章编号：1607-2286（2007）06-0508-03证型：IAD【摘要】目的：改进和应用双抗体夹心ELISA法检测鼠肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）。方法：采用物理吸附和戊二醛共价交联两种方法分别包被抗大/小鼠TNF-α抗体，以建立物理吸附和化学交联两种ELISA法，比较它们的灵敏度与线性范围，而且将其应用于研究LPS刺激RAW264.7细胞生成TNF-α的时程变化。结果：两种ELISA法的灵敏度分别为5、20pg/ml，线性范围分别为20～1280pg/ml、5～5120pg/ml。结论：经过包被方法改进的ELISA法大大地提高了检测水平，值得推广应用。【关键词】肿瘤坏死因子-α；酶联免疫吸附实验【Abstract】Aim:ModificationandapplicationofELISAfordetectionofMurineTNF-α.Methods:Ananti-TNF-αantibodywaseit-herphysicllyabsorbedtoicrowellsorimmobilizedtoglutaraldehyolecoatedonicrowellandtheSandwichELISAforthedetectionofmur-ineTNF-αwasestablished.ThesensitivityandlinearityoftwoELISAmethodswerecompared.WealsoappliedittostudyTNF-αproduct-ionofRAW264.7cellsstimulatedLPS.Result:themethodofanti-TNF-αantibodycoatedonicrowellsbychemicalcross-linkingremarkab-lyincreasedthesensitivityandlinearityofELISA.Conclusion:ThemodifiedELISAcangreatlyimprovethelevelofdetectionofmurineT-NF-α.【Keywords】TNF-α;ELISA肿瘤坏死因子（TNF-α）是一种主要由激活的单核/巨噬细胞分泌产生，具有广泛的生物学活性的细胞因子。TNF-α能诱导如NFκB、c-fos、c-jun等基因的表达，参与机体免疫反应的调控，对肿瘤细胞具有细胞毒性、生长抑制作用，介导内毒素休克和炎症反应，抑制脂蛋白酶的活性，启动破骨及抑制成骨作用，引起心功能紊乱等。研究表明，它与临床许多疾病发生和转归密切有关[1-4]。因此对于如何提高其检测水平是非常有意义的。本实验对包被方法进行了改进，采用戊二醛共价交联化学方法包被抗体TNF-α，以建立双抗体夹心ELISA法。然后将其应用于研究脂多糖（LPS）诱导RAW264.7细胞产生TNF-α的时程变化。结果比较满意，现报告如下。1材料和方法1.1材料鼠TNF-α标准品，仓鼠抗大/小鼠TNF-α单克隆抗体，生物素化兔抗大/小鼠TNF-α多克隆抗体以及酶结合物Av-HRP（为BDPharMingen公司）。二甲基亚砜（DMSO，Sigma），30%过氧化氢（H2O2，Sigma），脂多糖（LPS，Sigma），3，3，，5，5，-四甲基联苯胺（TMB，天象人进口分装），小牛血清白蛋白（BSA，上海生化研究所）。其余试剂均为国产分析纯。包被液为0.05MPH9.6的碳酸盐溶液；洗涤液为0.05%吐温-20的0.01MPH7.4PBS溶液；封闭液为3%小牛血清白蛋白（BSA）的洗涤液；稀释液为0.5%BSA的洗涤液；底物溶剂为PH6.0的乙酸钠溶液。TMB原溶液：25mgTMB溶于2mlDMSO。底物液为：10ml乙酸钠溶液加100ulTMB原溶液和10ul30%的H2O2（临用前时配制）。聚苯乙烯96孔酶标板为Coster公司出品。MR5000型酶联检测仪为美国Unitedkingdom公司出品。1.2双抗体夹心ELISA法检测鼠TNF-α的建立物理吸附法：用传统的物理吸附方法包被酶标板[5]，即用0.05MPH9.6的碳酸盐溶液将仓鼠抗大/小鼠TNF-α抗体稀释成6ug/ml溶液，包被酶标板，每孔100ul，先室温孵育2小时，然后4℃过夜。洗板1次。加入封闭液，每孔200ul，室温1小时，洗板3次。用稀释液将生物素化兔抗大/小鼠TNF-α抗体稀释成1ug/ml加入各孔，每孔100ul，室温1小时，洗板5次。加入1：1000稀释的酶结合物Av-HRP，每孔100ul，室温30分钟，洗板5次。每孔加入底物液100ul，室温避光，反应10分钟左右，加50ul终止液终止反应。即刻测OD450nm值。化学交联法：用化学共价交联方法包被聚苯乙烯酶标板，按文献[6]的方法处理酶标板。取酶标板的若干孔，每孔加入100ul1.25mM的戊二醛溶液37℃孵育4小时，用PBS洗涤两次后，其余步骤同物理吸附法。1.3两种ELISA法灵敏度和线性比较测定：1ug/ml鼠TNF-α标准品用细胞培养液倍比稀释，使得浓度分别为5，20，80，320，1280，5120，20480pg/ml，以模拟阳性标本。再分别用在以上两种方法平行测定，观察其灵敏度和线性。1.4化学交联法的方法学评价[7]取3份TNF-α浓度不同（高、中、低）的细胞培养上清，分别进行测定，观察方法的精密度。在含有已知TNF-α浓度CJCM中华实用中西医杂志2007年VOL.(20)NO.6-509-的细胞培养上清中，加入不同量的TNF-α标准品，将实测值与理论值比较，观察方法的准确性。用抗体中和实验，观察方法的特异性。按同样的实验条件将60份样品反复检测2次，观察方法的重复性。1.5应用化学交联法对RAW264.7细胞上清液TNF-α的测定用含10%小牛血清的DMEM完全培养基接种RAW264.7细胞于24孔板中，置5%CO237℃细胞培养箱中培养2天，大约有2×106个细胞/孔。换上新鲜的DMEM完全培养基0.5ml/孔，加入LPS使其终浓度为100ng/ml分别处理RAW264.7细胞6，12，24小时。正常培养的RAW264.7细胞作为对照组。到设计时间后，取其培养液，3500转/分离心30秒后取上清液100ul，用于化学交联ELISA法检测TNF-α。2结果2.1实验条件：物理吸附法中包被聚苯乙烯酶标板的抗鼠TNF-α抗体浓度，生物素化抗鼠TNF-α抗体以及酶结合物Av-HRP使用浓度，均由棋盘实验确定。2.2灵敏度：上述两种方法分别读取10个零标准OD值，计算其均值X及标准差S，X+3S对应的TNF-α浓度值为昀低检测限。两者的昀低检测限（即灵敏度）分别为5和20pg/ml。2.3测定的线性范围：物理吸附法中当TNF-α浓度为1280pg/ml以上时，其标准曲线偏离直线，故其线性范围为20～1280pg/ml；而化学交联法中当TNF-α浓度为5120pg/ml以上时，其标准曲线偏离直线，故其线性范围为5～5120pg/ml（见图1）。图1两种ELISA方法测定鼠TNF-α标准曲线2.4ELISA化学交联法的的精密度和准确性取3份TNF-α浓度不同（高、中、低）的细胞培养上清，分别进行测定，结果批内重复性变异系数为3.6％～9.2%，批间重复性变异系数为4.1%～10.7%。在含有已知TNF-α浓度的细胞培养上清中，加入不同量的TNF-α标准品，将实测值与理论值比较（见图2），当TNF-α浓度为50、200、1000pg/ml时回收率分别为95%、98%、93%。图2ELISA化学交联法检测TNF-α含量与理论值的比较2.5ELISA化学交联法的特异性和重复性：取TNF-α100pg/ml加过量的TNF-α单抗（10ug/ml）置37℃30分钟作用后，重新测定TNF-α抗原，结果中和后OD值均下降96%以上。而且和其他细胞因子均无交叉反应。60份阳性标本的2次检测符合率为96.67%（57/60）。2.6LPS刺激RAW264.7细胞生成TNF-α的时程变化结果表明LPS能诱导RAW264.7细胞产生大量的TNF-α。如图3所示，LPS未处理（对照）和处理6，12，24小时，RAW264.7生成TNF-α的量分别为113±5、1304±143、1987±126、2236±175pg/ml（X±SD，n=6）。3讨论肿瘤坏死因子是一种具有广泛生物学活性的细胞因子，其在体内水平异常变化与某些疾病的病因和病理过程有着密切的相关性。然而TNF-α在体内异常变化的水平还是比较低的，所以如何提高检测TNF-α的灵敏度是个重要的课题。目前国内外常用的检测TNF-α方法有生物活性检测法（bioassay，BA）和ELISA法等。由于ELISA法具有灵敏度高、特异性强、重复性好、操作简便等特点，尤其是双抗体夹心ELISA法近年来在临床和科研中已经成为检测TNF-α昀常用的方法之一，但其在技术上尚需完善。我们知道，在双抗体夹心ELISA法中，包被抗体这一环节是至关重要的。它不仅决定ELISA法能否建立，还可影响到ELISA法的灵敏度、准确度、重复性及线性范围等。传统的包被方法是用常规0.05MPH9.6碳酸盐缓冲液被动的物理吸附方法，使抗体包被到酶标板上。然而有人[8]报道物理吸附法会导致蛋白质分子的构象改变，Suter等[9]证实物理吸附会造成蛋白质分子的功能下降。因此研究如何改善物理吸附法的局限性，从而更好地将抗体包被到酶标板上，这对于建立灵敏度高，特异性强，重复性好以及线性范围广的ELISA法是很有意义的。VgniosDH等[6]研究表明：预先用戊二醛固定聚苯乙烯酶标板，能显著提高Aggrecan和spermine的结合能力。因此，我们设想用戊二醛固定预先处理酶标板，可能会提高ELISA法的灵敏度及检测范围。于是，我们试用与大/小鼠TNF-α有交叉反应的TNF-α抗体，并对包被抗体方法作了改进，采用戊二醛共价交联化学包被方法，建立检测鼠TNF-α的双抗体夹心ELISA法。并比较了其和传统的ELISA法的灵敏度及线性范围。本实验表明，用戊二醛共价交联的化学方法包被抗体能显著提高ELISA法的灵敏度及线性范围。许斌等[10]用原子力显微镜（FAM）观察了聚苯乙烯酶标板的戊二醛醛化过程是依赖于疏水作用，醛基朝外。而醛基与抗体蛋白质的氨基形成共价交联。共价交联的抗体层活性结合位点全部暴露于外，与抗原的结合能力及量大大多于物理吸附。由此说明用戊二醛共价交联包被抗体，确能显著增加ELISA法的灵敏度，使其线性范围更宽。另外，化学交联法的特异性、重复性测定表明，二者的重合率均在95%以上，而与其它细胞因子不发生交叉干扰作用。本法正好克服了单克隆抗体灵敏度低，多可隆抗体特异性差的缺点。我们还用化学交联ELISA法研究LPS刺激RAW264.7细胞产生TNF-α的时程变化，结果与文献报道相似[2，11]，说明此法具有应用价值。