ELISA原理

ELISA知识简介六和集团质检中心2010-6-26•ELISA的发展历程•ELISA的原理•ELISA的类型•ELISA的试剂准备•ELISA操作注意事项一、ELISA的发展历程•免疫酶标记技术是继免疫荧光抗体技术和放射免疫分析之后发展起来的一大新型的血清学技术。1966年，Nakane和Avrameas等分别报道用酶代替荧光素标记抗体，建立了酶标抗体技术（enzyme-labelledantibodytechnique），用于生物组织中抗原的定位和鉴定。1971年，Engvall，VanWeemen等报道了酶联免疫吸附试验，从而建立了酶标抗体的定量检测技术。20世纪80年代，酶标记抗体检测和鉴定蛋白质分子的免疫转印技术问世，目前，免疫酶标记技术已成为免疫诊断、检测和分子生物学研究中应用最广泛的免疫学方法之一。二、ELISA的原理•ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合的一种敏感性很高的实验技术。•基础:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留其酶的活性。•测定时，受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应，洗涤加入酶标记抗原或抗体，加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。免疫酶标记类型免疫酶标记免疫酶标测定固相免疫酶测定免疫酶组化均相免疫酶测定液相免疫酶测定非均相免疫酶测定•均相EIA可不需进行游离的和结合的标记物的分离而直接测定标记物。均相EIA在临床检验中较少应用。•非均相EIA需先进行游离的和结合的标记物的分离。这种固相免疫酶测定方法在1971年最初建立时称为酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbentassay），简称ELISA。1.1抗原抗体反应1.1.1可逆性•抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：•Ag+Ab→Ag·Ab•抗体的亲和力可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab],Ag·Ab的解离程度与K值有关。•高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。1.1.2特异性•抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。•测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。1.1.3最适比例1.1.4敏感性•化学比色法的敏感度为mg/ml水平•酶反应测定法的敏感度约为5-10μg/ml•免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿•标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平•例如，HBsAg，其敏感度可达0.1ng/ml。1.4免疫测定在临床检验中的应用•由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原，尤其采用基因工程方法制备包被抗原来检测样本中的相应抗体，都大大提高了ELISA的特异性，加之电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用，使ELISA更为简便实用和标准化，从而使其成为最广泛应用的检测方法之一。•综上，由于ELISA具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用。三、ELISA的类型•ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体，即“免疫吸附剂（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为“结合物”（conjugate）；（3）酶反应的底物。•可设计出各种不同类型的检测方法。双抗体夹心法示意图固相载体抗体抗原酶抗体酶标记抗体1.将抗体包被在固相载体上。2.如样品中含有抗原，则结合为抗原抗体复合物。3.再加入酶标记抗体，则结合为抗体-抗原-酶标记抗体复合物。4.酶催化底物并显色。双抗原夹心法示意图1.将抗原包被在固相载体上。2.如样品中含有抗体，则结合为抗原抗体复合物。3.再加入酶标记抗原，则结合为抗原-抗体-酶标记抗原复合物。4.酶催化底物并显色。酶抗原酶标记抗原抗体抗原固相载体酶抗抗体酶标记抗抗体抗体抗原固相载体1.将抗原包被在固相载体上。2.如样品中含有抗体，则结合为抗原抗体复合物。3.再加入酶标记抗抗体，则结合为抗原-抗体-酶标记抗抗体复合物。4.酶催化底物并显色。间接法示意图捕捉法示意图酶抗体酶标记抗体抗原抗抗体固相载体抗体1.将抗抗体包被在固相载体上。2.如样品中含有抗体，则结合为抗抗体-抗体复合物。3.加入抗原及酶标记抗体，则结合为抗抗体-抗体-抗原-酶标记抗体复合物。4.酶催化底物并显色。酶标抗原竞争法示意图固相载体抗体抗原酶酶标记抗原1.将抗体包被在固相载体上。2.如样品中含有抗原，则优先竞争结合抗体，结合为抗原抗体复合物。3.同时加入酶标记抗原，抗原没有结合的位点酶标记抗原去占据，则结合为酶标记抗原-抗体复合物。4.酶催化底物并显色。抗原四、ELISA的试剂•ELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物。•（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；•（2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；•（3）酶的底物；•（4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品；•（5）结合物及标本的稀释液；•（6）洗涤液；•（7）酶反应终止液免疫吸附剂•固相载体--聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。•聚氯乙烯--聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。•良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。•将抗原或抗体固定在固相载体上的过程称为包被(coating)。•蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。包被方式•不易吸附的非蛋白质抗原可用间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法。•亲和素生物素即用亲和素先包被载体，加入生物素化的DNA，这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。•脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。•优点：试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复性亦佳。抗原用量少，仅为直接包被的1/10乃至于/100。•包被用抗原：•天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。•合成多肽抗原是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。包被用抗体•IgG对聚苯乙烯有强吸附力，其联结发生在Fc段上，抗体结合点暴露于外。•取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液.须除去杂抗体后才能用于ELISA，以保证试验的特异性。•腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收层析处理，直接包被。在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。包被的条件pH9.6碳酸盐缓冲液pH7.2的磷酸盐缓冲液pH7-8的Tris-HCL缓冲液。•加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置过夜，37℃中保温2小时。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为10ng/ml-20ug/ml。封闭•封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。•常用封闭剂：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明胶;脱脂奶粉,比较价廉，可以高浓度使用（5%）。•所有的ELISA固相均需封闭。结合物•即酶标记的抗体（或抗原）是ELISA中关键的试剂•酶的催化活性•抗体（或抗原）的免疫活性•含有或少含有游离的抗体（或抗原）•结合物尚要有良好的稳定性。结合物用的抗原和抗体•制备结合物时所用纯度较高的IgG，以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。最好用层析纯化的抗体，这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反应，实验结果本底浅淡。在ELISA中用酶标抗原的模式不多，总的要求是抗原必须是高纯度的。酶•纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富，价格不贵，受检标本中不存在相同的酶。•酶结合物保留活性部分和催化能力，底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定等。•在ELISA中，HRP，AP，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。•HRP是一种糖蛋白，含糖量约为18%，分子量为44000，是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成，是一种卟啉蛋白质。底物•HRP的底物•DH2+H2O2D+2H2O•上式中，DH2为供氢体，H2O2为受氢体。•DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。•DH2如：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)等。•OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。•TMB经HRP作用后共产物显蓝色。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液。酶反应终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为450nm。五、基本操作注意事项•加样:•在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。•保温•抗原抗体完成反应的保温过程称为温育•应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。洗涤•洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。•ELSIA洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。•清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。•可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。显色•显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。比色•拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪中。谢谢