实验三ELISA检测溶血素

实验三ELISA检测溶血素【试剂与器材】绵羊红细胞（SRBC）免疫小鼠血清抗SRBC阳性和阴性血清辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗甲胎蛋白抗体碳酸盐缓冲液（PH9.6）磷酸盐缓冲液（PBS，PH7.4）邻笨二胺液硫酸（2M）酶标反应板、微量加样器、温箱、冰箱、酶标仪等。【试剂与器材】包被稀释液（0.05mol/LNa2CO3—NaHCO3缓冲液，PH9.6）Na2CO31.5gNaHCO32.9g加双蒸水至1000ml封闭液（5%小牛血清/PBS溶液）小牛血清50mlPBS（PH7.4）950ml洗涤液（PBST，PH7.4）NaCl8.0gKH2PO40.2gNa2HPO4.12H2O2.9gKCl0.2gTween200.5ml加双蒸水至1000ml【试剂与器材】样本稀释液（PBS，PH7.4）NaCl8.0gKH2PO40.2gNa2HPO4.12H2O2.9gKCl0.2g加双蒸水至1000ml酶标第二抗体：羊抗人IgG标记HRP（1：2000）【试剂与器材】底物液（OPD—H2O2）A液（0.1mol/L柠檬酸溶液）柠檬酸19.2g加双蒸水至1000mlB液（0.2mol/LNa2HPO4溶液）Na2HPO4.12H2O71.7g加双蒸水1000ml临用前取A液24.3ml，B液25.7ml终止液（2mol/LH2SO4溶液）双蒸水600ml，浓硫酸100ml（缓慢滴加并不断搅拌），加双蒸水至900ml【操作方法】（1）包被酶标反应板用pH9.6的碳酸盐缓冲液1：200稀释抗体，用之包被聚乙烯塑料板，每孔加0.2ml，4°C12~24h。（2）封闭酶标反应板弃掉包被液，用PBS洗涤3次，甩干后用5%小牛血清/PBS液封闭。放37°C40min（或4°C过夜）。封闭结束后用洗涤液洗板，并在滤纸上拍干，每孔洗3遍，每遍3min。ELISA平板包被间接法抗原包被:将包被液稀释的抗原（SRBC）BSA（2-10ug/ml）加入96孔酶标版中，每孔100ul，4C过夜。吸出上清液，加入封闭液200ul/孔。37C封闭1-1.5小时或4C过夜。封闭结束后用洗涤液洗板3次，每次3分钟。【操作方法】（3）按图1-11所示加入待测样品及阳性对照（用PBS稀释）将稀释好的待测血清样品加入酶标反应板中，每孔0.2ml，阳性对照样品亦相应稀释。置于37°C温箱0.5~1h。弃去孔中液体，用洗涤液洗涤3遍，每遍3min。（4）加酶标二抗（用PBS稀释）加入辣根过氧化物酶标记的抗甲胎蛋抗体，每孔0.2ml置于37°C温箱，30~45min。弃去孔中液体，拍干，每孔洗涤3遍，每遍3min。【操作方法】（5）加入底物液取底物液：A液24.3ml，B液25.7ml，加双蒸水50ml得pH5.0的磷酸—枸缘酸缓冲液100ml。再加入邻苯二胺40mg，充分溶解，最后加入30%H2O20.15ml。每孔加入底物液100μl。避光室温作用5~10min。（6）终止反应当阳性对照出现明显颜色变化后，每孔加入终止液50μl终止反应。【结果分析】目测：根据显色深浅，用（-）为无色，（+）为浅色，（++）为黄色，（+++）为棕黄色表示。一般呈++以上者为阳性酶标仪测定：在492nm波长下测OD值（A492）。当待测样品A492值与阴性对照A492值的比值（P/N）大于2.1时，或待测样品A492对照A492值‾+3s，即可判断为阳性。以最大显色至阳性显色孔的50%反应孔的抗体稀释倍数为抗体效价。x【注意事项】1.封闭时注意将封闭液加满各反应孔，并去除各孔中可能产生的贴孔壁气泡。2.加洗涤液时，每孔加满，但不要溢出。3.每次洗涤液在孔中的停留时间不应少于1分钟。4.洗涤后板要甩干，不要残留液体。