实验八酶联免疫吸附试验（ELISA）教学要求

一教学要求•掌握酶联免疫吸附试验的基本方法及其原理•学习双抗夹心法检测抗原物质的基本操作实验八酶联免疫吸附试验（ELISA）二实验原理酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbentassay简称ELISA)是在免疫酶技术(immunoenzymatictechniques)上发展起来的一种新型免疫测定技术，ELISA过程包括：抗原吸附在固相载体上，这个过程称为包被，加待测抗体,再加相应酶标记抗体，生成抗原--待测抗体--酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体的量。待测抗体的量与有色产物成正比。同理也可包被抗体，测定抗原含量。ELISA最常用的四种方法：直接法测定抗原；间接法测定抗体；双抗体夹心法测定抗原；竞争法测定抗原。（1）直接法测定抗原A.将抗原吸附在载体表面；B.加酶标抗体，形成抗原—抗体复合物；C.加底物。底物的降解量＝抗原量。（2）间接法测定抗体A.将抗原吸附于固相载体表面；B.加抗体,形成抗原-抗体复合物;C.加酶标抗体；D.加底物。测定底物的降解量＝抗体量。（3）双抗体夹心法测定抗原A.将抗体吸附于固相表面;B.加抗原，形成抗原-抗体复合物;C.加酶标抗体;E.加底物。底物的降解量＝抗原量。（4）竞争法测定抗原A.将抗体吸附在固相载体表面;B.加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体；对照只加入酶标抗原；C.加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知抗原量。三材料与器材（略）（1）抗体包被：羊抗人IgG酶联板每孔加100µL，4℃过夜；甩净。（2）封闭：2%小牛血清，每孔加100µL，37℃封闭30min；封闭后洗三次（前两次用自来水冲、甩；第三次用洗液，并静置3min，甩）（3）加待测抗原：正常人血清稀释成,1:5,1:10,1:20,1:40,1:80,生理盐水作为对照，每孔加100µL，注意从高稀释度到低稀释度加样，37℃孵育1h；洗三次（4）加酶标抗体：HRP-IgG（PBS-Tween，5%BS；1：800稀释），每孔加100µL，37℃，30min；洗三次四操作步骤（5）酶催化反应：底物显色剂（0.2mol/LNa2HPO4加1:1的0.1M柠檬酸，3%H2O2加1.5µL/mL，TMB（DMSO溶，10mg/mL）每孔加50µL，37℃闭光反应15min；（6）加2mol/LH2SO450µL终止反应，观察颜色反应，并用酶标仪测量OD。五注意事项（1）正确洗涤酶标板，加洗涤液时要小心，勿使洗涤液溢出，流入周围孔中，造成交叉污染。洗涤后应尽量甩干孔内残液。洗涤液加入孔后，须保持3min再弃去。（2）加样品时应从最高稀释度逐一加至最低稀释度，这样可以不换吸头。（3）底物应在临用前配制，同时注意避光。六思考题（1）分析酶标抗体不纯对抗原检测结果的影响（双抗夹心法）（2）比较免疫荧光法和ELISA的最适检测对象。