莱克多巴胺酶联免疫吸附法（ELISA）的建立

中国农业科学院硕士学位论文莱克多巴胺酶联免疫吸附法（ELISA）的建立姓名：于洪侠申请学位级别：硕士专业：动物营养与饲料科学指导教师：杨曙明20050601莱克多巴胺酶联免疫吸附法（ELISA）的建立作者：于洪侠学位授予单位：中国农业科学院相似文献(9条)1.期刊论文熊浩山.彭莉.岳秀英.高岚.官艳丽.王海波.吴晓岚酶联免疫吸附法测定猪尿中莱克多巴胺残留的研究-四川畜牧兽医2007,34(5)用酶联免疫吸附法对猪尿中莱克多巴胺进行了残留检测,结果:该方法的最低检测限为0.92μg/L;50%抑制浓度的平均值为2.7μg/L;回收率在(65.2±3.9)%～(86.6±6.1)%,批内变异系数≤17.8%,批间变异系数小于≤15.6%.试验表明该方法可用于莱克多巴胺残留量的筛选检测.2.期刊论文赖卫华.张国华.徐国茂.LAIWei-hua.ZHANGGuo-hua.XUGuo-mao不同贮藏时间及温度下莱克多巴胺浓度变化的研究-食品与机械2009,25(6)研究猪尿中的莱克多巴胺浓度在不同贮藏时间及温度下的变化.猪尿中加入莱克多巴胺后分别在室温、冷藏和冷冻条件下立即贮藏.在贮藏1,7,14,21d后分别用酶联免疫吸附法对尿样中的莱克多巴胺进行定量检测.21d后,冷冻保存尿样中的莱克多巴胺的浓度从3.14ng/mL降到1.59ng/mL,比室温和冷藏条件下保存更加稳定.因此,尿样收集后应该尽快冷冻贮藏.3.学位论文邓爱科亲和层析-酶联免疫吸附法检测β,2-兴奋剂的研究2006本研究采用混合酸酐法制备莱克多巴胺(Ractopamine，RCT)免疫抗原和沙丁胺醇(Salbutamol，SAL)免疫抗原，经鉴定RCT免疫抗原(RCT-BSA)的偶联比率为25.8∶1，包被抗原(RCT-OA)的偶联比率为48.41∶1，SAL免疫抗原(SAL-BSA)的偶联比率为12.8∶1，包被抗原(SAL-OA)的偶联比率为18.7∶1。采用重氮化法制备克伦特罗(Clenbuterol，CL)免疫抗原，CL免疫抗原(CL-BSA)的偶联比率为24.21∶1，包被抗原(CL-OA)的偶联比率为13.63∶1。利用制备好的抗原免疫家兔，获得抗RCT抗血清，抗CL抗血清，抗SAL抗血清，以制备相应的多克隆抗体。采用间接酶联免疫吸附检测法(ELISA)对抗血清效价进行了检测，抗RCT抗血清，抗CL抗血清，抗SAL抗血清最高效价分别为1∶32000，1∶16000，1∶16000。经鉴定三种抗血清的特异性较高和与各自抗原同系物的交叉反应率也很低。在优化包被抗原浓度，封闭条件，抗体和酶标二抗的浓度，显色时间等条件的基础上，采用间接竞争ELISA法建立检测RCT，CL，SAL的标准曲线，三者分别在0.55ng/mL-1.21μg/mL、2.71ng/mL-0.66μg/mL、1.48ng/mL-3.24μg/mL浓度范围之间，呈良好的线性相关，RCT、CL、SAL的最小检测极限0.55ng/mL、2.71ng/mL、1.48ng/mL。将各抗原以1，10，100ng/g的浓度添加时，猪肉组织，猪尿液中的回收率在78.33％-119％范围内。在间接竞争ELISA方法的基础上，制备了RCT，CL，SAL间接竞争酶联免疫吸附检测技术，可用于检测动物肌肉组织、尿液中RCT，CL，SAL的残留量。为进一步降低检测限，在间接竞争ELISA的基础上，利用抗RCT抗体，抗CL抗体，抗SAL抗体制备免疫亲和层析柱(IAC)，先将样品中RCT，CL，SAL富集，再进行间接竞争ELISA检测，建立了检测RCT，CL，SAL留的亲和层析柱-酶联免疫吸附(IAC-ELISA)检测技术。经优化后IAC-ELISA方法的检测限可降低一个数量级，达0.01ng/g。4.期刊论文张亚峰.张会彩.刘聚祥.王建平酶联免疫吸附法检测猪肉和猪尿中莱克多巴胺残留-兽药与饲料添加剂2009,14(2)以莱克多巴胺单克隆抗体间接竞争酶联免疫吸附(ELISA)法测定猪肉和猪尿中莱克多巴胺残留.该法对莱克多巴胺的检测限为0.8ng/mL(g),在空白组织中的添加同收率为80.4%～109.5%,变异系数为5.8%～12.6%.5.学位论文周守长莱克多巴胺单克隆抗体的制备及初步应用2008莱克多巴胺(Ractopamine，Rac)是一种β2-肾上腺素受体激动剂，最初被用来治疗支气管哮喘病，后来发现该药物还具有促进生长、营养重分配的作用，故被作为饲料添加剂用于畜禽生产。但动物或人直接或间接大量食入该药物时，可能会发生中毒。目前，我国禁止该药物用于养殖业。由于利益驱使，少数不法商人将该药物添加于动物饲料中，给国民健康带来潜在的威胁。本研究旨在制备特异针对Rac的单克隆抗体，并建立直接竞争酶联免疫吸附法(cELISA)用于Rac的残留检测。应用混合酸酐法，将莱克多巴胺分别与匙孔蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、鸡血清白蛋白(OVA)以及辣根过氧化物酶(HRP)进行偶联，经紫外光谱扫描确定偶联成功，测定偶联物的蛋白浓度分别为3.6mg/ml、6.2mg/ml、4.4mg/ml、1.2mg/ml。以Rac-KLH、Rac-BSA为免疫原，Rac-OVA为检测原，应用单克隆抗体技术获得4株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为1F7、2G9、4D2、5A9。经间接竞争ELISA试验表明：Rac小分子对1F7、5A9两株细胞产生的单克隆抗体无竞争抑制作用，对2G9、4D2具有抑制作用，半数阻断浓度(ICso)分别为1000ng/ml、2ng/ml，亚类鉴定其免疫球蛋白亚类分别为IgM和IgGl，单抗腹水的间接ELISA效价分别为10×28和10×210。特异性鉴定结果显示，单抗与Rac的类似物盐酸克伦特罗及两种偶联载体均不发生交叉反应。上述结果表明单抗2G9、4D2可作为进一步建立竞争ELISA检测方法的生物材料。以单抗4D2包被酶标板，经方阵试验确定单抗的最佳包被浓度及酶标抗原的工作浓度，基于以上结果建立了用于检测Rac药物残留的直接竞争ELISA，对标准品的检测下限可达10ng/ml，线形检测范围为10—100ng/ml。根据标准品的检测结果可见，本方法可以作为Rac残留检测的筛检方法。本方法有待进一步提高敏感性，并进一步探索临床样品的处理条件。6.期刊论文申宏丹.窦红.高春平.许丽丽.SHENHong-dan.DOUHong.GAOChun-ping.XULi-li直接竞争酶联免疫法检测菜克多巴胺研究-动物医学进展2009,30(8)RAC的其他类似物几乎不发生交叉反应,猪尿样品中平均添加回收率为104%,表明建立的直接竞争酶联免疫吸附法可用于对莱克多巴胺的残留检测.7.学位论文阳露莱克多巴胺单克隆抗体的研制及其ELISA检测方法的建立2007莱克多巴胺(Ractopamine，Rac)是一种β,2-肾上腺素能兴奋剂，因具有营养再分配、促进蛋白质合成，增加动物酮体瘦肉率，提高饲料转化率的作用，可能被非法作为饲料添加剂用于畜产品的生产，但其残留对人类健康存在潜在的危害，被禁止或限定存畜产品生产中使用。本研究旨在制备特异性针对莱克多巴胺的单克隆抗体，并建立竞争酶联免疫吸附法(cELISA)用于Rac的残留检测。将阳离子化牛血清白蛋白(cBSA)和半抗原Rac进行偶联，经紫外光谱扫描确定偶联成功，测定偶联物的蛋白浓度为0.70mg/ml。以此偶联物Rac-cBSA作为免疫原，与试剂盒自带佐剂乳化后免疫6周龄雌性BALB/c小鼠，每次免疫间隔2周，待血清抗体效价明显升高后加强免疫，3天后取小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/O-Ag-14进行融合。旧时用混合酸酐法将Rac与鸡卵清白蛋白(OVA)偶联。以偶联产物Rac-OVA作为包被抗原，经间接ELISA试验筛选出阳性细胞株，再用有限稀释法进行多次亚克隆，获得稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为5D,2和6B,3。经亚类鉴定其免疫球蛋白亚类均为IgM，单抗腹水的间接ELISA效价分别为2×10'5和1×10'5。该细胞株经体外培养、传代、冻存和复苏后抗体性质稳定。特异性鉴定结果显示，单抗与Rac的类似物盐酸克伦特罗及两种偶联载体均不发生交叉反应。采用cELISA试验鉴定单抗的敏感性，68,3的IC,50为0.01ng/ml，5D,2的IC,50为0.1ng/ml。说明单克隆抗体具有较好的亲和性。将ELISA检测条件进行了优化，得到的最佳反应条件为：包被时间37℃作用3h，封闭条件为37℃作用3h，封闭液选用1％明胶。用方阵滴定法确定最适包被抗原稀释倍数为1:1600，单抗的最适稀释倍数为1:8000，采用cELISA方法建立检测Rac的标准曲线，在0.1ng/ml-100ng/ml范围内呈线性相关，回归方程为Y=-0.4052X+0.0111，相关系数R'2=0.9815。用cELISA法检测Rac有着良好的应用前景，但是试剂盒的组成元件和条件还需要进一步探索，最佳反应条件还需要进一步优化。8.期刊论文王建平.史为民.何方洋.万宇平.沈建忠酶联免疫吸附法检测猪尿中的莱克多巴胺-中国兽医杂志2006,42(12)莱克多巴胺(Ractopamine,RAC)属于β2-兴奋剂的一种,它作为饲料添加剂使用,能显著促进动物生长,增加饲料转化率和瘦肉率[1～3],已经被美国及其他一些国家批准作为猪的饲料添加剂.但包括RAC在内的β2-兴奋剂在我国及欧盟都被禁止在食品动物的饲养过程中使用.9.学位论文王寿利盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备及其间接ELISA检测方法的建立2009盐酸克伦特罗(ClenbuterolHydrochloride，CL)是一种β-肾上腺素受体激动剂，因具有营养再分配、促进蛋白质合成、增加动物酮体瘦肉率、提高饲料转化率的作用，常常被非法作为饲料添加剂用于畜产品的生产，但其残留对人类健康存在潜在的危害，虽然被禁止在畜产品生产中使用，但是违法添加甚至造成消费者中毒的事件屡见不鲜。本文通过研制针对CL的单克隆抗体，初步建立了检测CL的间接竞争酶联免疫吸附法(ciELISA)，在CL残留的快速筛检具有良好的特异性和敏感性。利用重氮法将CL小分子与载体蛋白OVA、BSA偶联，以CL-OVA为免疫原免疫Balb/c小鼠，以CL-BSA为检测原。采用杂交瘤技术获得4株(1A3、2B6、2F10、3F5)针对CL的单克隆抗体细胞株。实验表明，ELISA试验时1A3细胞上清受溶液介质的影响较小，只与CL反应，而不与载体蛋白、莱克多巴胺等反应，1A3抗体对沙丁胺醇的半数阻断浓度(IC50)1000ng/ml。因此以1A3为ELISA试验的抗体可以有效地避免了假阳性或者假阴性的产生。利用Protein-ASepharose亲和层析系统纯化单克隆抗体1A3，间接竞争ELISA的IC50为12.0ng/ml，检测线形范围为0.5～100ng/ml。采用辣根过氧化物酶(HRP)标记提纯的1A3单克隆抗体，建立的间接竞争ELISA检测方法具有良好的特异性和敏感性，间接竞争ELISA的IC50约为3.5ng/ml，对CL标准品的检测下限可达0.2ng/ml，检测线性范围为0.2ng/ml～16ng/ml。引证文献(2条)1.高翔.张燕.樊明涛利用生物素链霉亲和素放大酶联免疫方法检测猪肉中莱克多巴胺残留[期刊论文]-食品研究与开发2009(3)2.游金明.王自蕊.谯仕彦.贺平丽.李德发致仔猪过敏性大豆抗原蛋白β-conglycinin单克隆抗体的制备与鉴定[期刊论文]-中国畜牧杂志2008(17)本文链接：授权使用：上海海事大学(wflshyxy)，授权号：ecbad79e-b6dd-4340-acab-9dec01294359下载时间：2010年9月9日