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关注生物技术，服务生命科学试剂盒 本试剂盒用于定量检测豚鼠血清、细胞培养上清液、组织匀浆中的IL-5的浓度。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分,若有任何疑问请与嘉美生物联系，您将得到我们的技术支持。欢迎访问嘉美网站：您将得到更多信息。用途：1980年发现成纤维细胞经PolyI-C刺激后能产生一种抑制病毒复制的细胞因子,称为β2干扰素(IFN-β2)。以后的研究结果未能证实这种因子的直接抗病毒作用，但具有其它多方面的生物学功能，根据实验系统和功能的不同，被命名为杂交瘤/浆细胞瘤生长因子(hybridoma/plasmacytomagrowthfactor,HPGF)，B细胞分化因子(Bcelldifferentiationfactor,BCDF)，B细胞刺激因子-2(Bcellstimulatoryfactor2,BSF-2)，26kDa,溶细胞性T细胞分化因子(cytolyticTcelldifferentiationfactor,CDF)和肝细胞刺激因子(hepatocytestimulatingfactor,HSF)等。1986年统一命名白细胞介素6(interleukin6，IL-6)。1.IL-6的产生淋巴样和某些非淋巴样细胞均可产生IL-6。(1)T细胞:T细胞产生IL-6依赖于巨噬细胞或PMA。抗原提呈细胞刺激相应的T细胞克隆，以及HTLV-I感染的T细胞系等均可分泌IL-6。(2)B细胞:如SAC刺激而活化的B细胞。(3)单核细胞:LPS刺激单核细胞产生IL-6，某些单核细胞系如P388D1也可分泌IL-6。(4)成纤维细胞:可自发产生IL-6，其它因子或刺激物如IL-1、TNF、PDGF、IFN-β、PolyI-C、A23187、PMA等可促进IL-6的产生。(4)肾小球系膜细胞、角朊细胞、内皮细胞等在一定培养条件下均可产生IL-6。此外，肿瘤细胞或细胞系如MG63成骨肉瘤、T24膀胱癌、A549肺癌、7860肾癌、SK-MG-4神经胶质母细胞瘤、U373星状细胞瘤、心脏粘液瘤细胞和骨髓瘤细胞等也能分泌IL-6。最近发现垂体前叶中的folliculostellate)可产生IL-6，可能与败血症时LPS刺激导致GH、ACTH等激素水平升高有关。IL-1、TNF、IFN-β、PDGF、LPS、PolyⅠ-C、A23187和PMA等对IL-6的产生具有正调节作用。2.IL-6的分子结构和基因1985年Kishimoto等从人T细胞中首先获得IL-6cDNA克隆成功，人IL-6基因与小鼠有65％同源性。人IL-6基因位于第7号染色体，长约5kb，有5个外显子和4个内含子。在IL-6基因功能调节区基因中存在着几种转录控制元件(transcriptionalcontrolele-ment)，如糖皮质激素反应元件(glucocorticoidresponsiveelements,GRE)、AP-1结合位点、c-fos血清反应元件同源物(c-fosserumresponsiveelementhomology,c-fosSREhomology),cAMP反应元件(cycliAMPresponsiveelement,CRE)和NF-κB结合位点。IL-1、TNF等细胞因子可使IL-6启动子很快发生一过性的活化。IL-1反应的元件在IL-6启动基中-180/-123;IL-6核因子(NF-IL-6)识别一段特殊的14bp,ACATTGCACAATCT。多反应元件(multi-responseelement,MRE)位于c-fosSRE同源区内，这个区域对IL-1、TNF、forskolin和PMA诱导IL-6产生有关；与IL-1、TNF刺激TL-6产生有关的NF-κB位于TATA盒的上游。关注生物技术，服务生命科学个氨基酸残基组成，包括28个氨基酸残基的信号序列，成熟IL-6为184氨基酸残基，分子量26kDa。IL-6分子由4个α螺旋和C端(175～181位氨基酸)受体结合点所组成，其中179位精氨酸残基对于与受体的结合非常重要。分子中糖基对生物学活性功能并非必需，N端23个氨基酸残基虽不直接与IL-6生物学活性有关，但对整个IL-6分子组成起稳定作用。人IL-6氨基酸序列与小鼠IL-6有42％同源性，人的IL-6对小鼠某些细胞有刺激作用。IL-6与G-CSF和IFN-β有较高同源性，对骨髓造血细胞和髓样白血病细胞的某些作用也有相似之处。3.IL-6的受体目前已知，IL-6R至少由称之为IL-6结合受体蛋白(IL-6bindingreceptorprotein)和称为信号转导蛋白(signal-transducingprotein)的gp130所组成，习惯上前者称之IL-6R。(1)IL-6R(CD126):人IL-6R由468个氨基酸组成,切除N端19个氨基酸残基后的成熟分子有449氨基酸，胞膜外区、穿膜区和胞浆区分别为339、28和82个氨基酸,分子量为80kDa,6个N糖基化位点。胞膜外区由一个Ig样区(C2，约100氨基酸)、2个Ⅲ型纤维结合蛋白结构(各含100氨基酸)及1个细胞因子受体的同源区所组成，后者含4个保守的Cys和一个WSXWS结构。单独IL-6R与IL-6结合为低亲和力。IL-6R分布于淋巴样细胞和非淋巴样细胞，如活化B细胞、EBV转化B细胞、急性淋巴母细胞白血病细胞、骨髓瘤细胞、静止T细胞、肝细胞、单核细胞、急性髓样白血病(AML)细胞、嗜铬细胞瘤细胞等。(2)gp130(CDw130):分子量为130kDa的糖蛋白，共有14个潜在N-糖基化位点，胞膜外区、穿膜区和胞浆区分别有597、22和277个氨基酸。胞膜外区有1个IgC2区，6个Ⅲ型纤维结合蛋白的结构,其中第二个和第三个结构区之间有4个保守的Cys和WSXWS结构的区域,形成1个细胞因子受体家族结构特征的结构域。gp130不能直接与配基IL-6结合，在生理情况下，IL-6与IL-6受体结合后使IL-6R的构象发生变化并迅速与两个gp130分子结合，形成高亲和力的结合位点，并通过gp130亚单位传递信号。人和小鼠gp130在氨基酸水平上有77％的同源性。转染gp130cDNA小鼠pro-B细胞在IL-6/sIL-6R复合物刺激下可传递增殖信号。小鼠体内注射IL-6可增加gp130mRNA的表达。目前已证实，gp130除组成IL-6高亲和力受体外，也是白血病抑制因子(LIF)、抑瘤素M(OSM)、睫状神经营养因子(CNTF)和IL-11等受体所共用的亚单位。(3)信号转导:gp130与IL-6/IL-6R复合物结合后，刺激gp130胞内部分发生酪氨酸磷酸化，目前关于参与此过程的酪氨酸蛋白激酶的作用还不清楚。酪氨酸激酶被激活后继而引起丝氨酸/苏氨酸激酶如丝裂原活化的蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinase,MAPK)的激活，使NF-IL-6中丝氨酸和苏氨酸磷酸化而被激活，从而促进相应基因的活化。(4)sIL-6R:存在于正常人尿、骨髓瘤细胞系U266培养上清，PHA活化人PBMC以及HTLV-I阳性细胞也能分泌sIL-6R,分子量为50kDa。用反转录PCR从正常人细胞和骨髓瘤细胞中均分离出编码sIL-6RmRNA，序列分析表明与膜结合受体相应区域序列一致。sIL-6也可从膜结合的IL-6R(mIL-6)脱落而来。sIL-6R与IL-12p40亚基具有高度同源性,而IL-6与IL-12的p35亚基序列高度同源。因此可以推测类似于IL-6/sIL-6R复合物的IL-12分子可能也通过类似于gp130分子作用于细胞。与其它可溶性细胞因子受体不同，sIL-6R结合IL-6后可与细胞膜表面gp130结合，增强IL-6的刺激活性。而可溶性gp130(sgp130)可抑制sIL-6R/IL-6复合物的活性。sIL-6R水平的升高与某些自身免疫性疾病有关。4.IL-6的生物学活性关注生物技术，服务生命科学(1)刺激细胞生长:IL-6可促进多种细胞的增殖，如B淋巴细胞杂交瘤、浆细胞瘤、EBV转化的B细胞、T细胞、PMA和IL-4刺激的胸腺细胞、造血干细胞、角朊细胞和肾小球系膜细胞。(2)促进细胞分化:如B细胞分化和Ig的分泌，CTL分化，协同IL-2增强CTL中穿孔素基因的表达，并增加T细胞IL-2产生和IL-2R表达，诱导巨噬细胞、神经细胞和NK细胞分化。协同IL-3促进干细胞分化和巨核细胞的成熟。明显促进小鼠骨髓移植后免疫功能的重建。(3)加速肝细胞急性期蛋白(acutephaseprotein)的合成。(4)抑制M1髓样白血病细胞系的生长,促进其成熟和分化；抑制黑素瘤、乳腺癌细胞生长。原理：本试剂盒采用双抗夹心ELISA法。抗豚鼠IL-6单抗包被于酶标板上，豚鼠标本中的IL-6会与单抗结合。加入生物素化的抗豚鼠IL-6（二抗），它将与结合在单抗上的豚鼠IL-6结合而形成免疫复合物，未结合的将被洗去。辣根过氧化物酶标记的Streptavidin将与二抗的生物素结合，多余的物质会被洗掉。加入TMB显色。豚鼠IL-6的浓度与OD(450nm)成正比。试剂盒组成：酶标板(CoatedWells)96wellsAnti-GuineapigIL-6Biotin2vials浓缩洗涤液(100X)(WashingConcentrate)10ml标准品(Standards)2vials显色液(TMBSubstrate)12ml标准品稀释液(StandardDiluent)15ml终止液(StopSolution)12ml浓缩酶联物（HRP）2vials酶联物稀释液(HRPDiluent)15ml生物素稀释液(BiotinDiluent)15ml需要但未提供的材料1.可在450nm处进行读数的酶标仪；2.能精确吸取10-200µL的移液器；3.可调多道（8）移液器（50－200µL）；4.供可调多道移液器使用的试剂存放槽；5.洗瓶或洗板机；6.蒸馏水或去离子水；7.1升的圆柱形量筒；8.血清移液器：1和（10或25mL）；9.移液器枪头；10.纸巾；11.计时器，用以监控温育步骤；12.处理池和消毒剂（例如：0.5%次氯酸钠,10%家用漂白水）；注意事项：1.严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。关注生物技术，服务生命科学洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入HRP或底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。3.消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。4.底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。5.避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。6.在储存和温育时避免强光直接照射。7.平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。8.任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。9.不能使用过期产品。10.如果可能传播疾病，所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。保存：贮藏于2-8°C。样品：在此检测中，可使用血清样品。准备工作：1.浓缩洗涤液(100X)用双蒸水稀释成1X（至500ml）。2.标准品用1ml标准品稀释液复溶。得到2000pg/ml的高浓度标准品。高浓度标准品可保存于-20°C。3.将2000pg/ml的高浓度标准品稀释成一组标准品，如：1000,500,250,125,62.5,0pg/ml。4.配制1xHRP：一支HRP加入6ml酶联物稀释液，混匀。1xHRP最好在临用前15分钟配制。5.配制1xBiotin：一支BiotinantiGuineapigIL-6加