酶联免疫吸附测定法(ELISA)在

酶联免疫吸附测定法（ELISA)在抗生素残留检测中的应用药物残留快速检测试剂盒实验操作指导1、酶联免疫吸附测定法（ELISA）简介1.1、基本概念：抗原、抗体、抗原抗体的特性1.2、ELISA方法简介：1.3、ELISA方法的原理1.4、ELISA方法的分类2、ELISA试剂的组成2.1、ELISA试剂盒的组成2.1.1、已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂，俗称酶标板）；2.1.2、酶标记的抗原或抗体（酶标记物）；2.1.3、酶的底物；2.1.4、参考标准品（定量测定）；2.1.5、酶标记物及样本的稀释液；2.1.6、洗涤液；2.1.7、酶反应终止液。2.2、各ELISA组成试剂的作用2.2.1、固相载体2.2.2、免疫吸附剂2.2.3、酶标记物2.2.4、酶的底物2.2.5、洗涤液2.2.6、反应终止液2.2.7、参考标准品3、ELISA实验过程3.1、试剂的准备3.2、加样3.3、保温3.4、洗涤3.5、显色和比色4、ELISA试验的质量控制4.1、分析前质控4.1.1、人员培训4.1.2、仪器质控4.1.3、标本采集及处理过程的质控4.2、分析中质控4.3、几种常用的质控方法4.3.1、灰区概念4.3.2、外添加回收率试验方法4.3.3、确证阳性样品质控4.3.4、室间质评的方法：发质控物进行调查5、胶体金试纸5.1、免疫层析法简介及特点5.2、免疫层析法的结构及原理二、培训内容（操作部分）6、操作过程演示7、计算软件应用说明1、酶联免疫吸附测定法（ELISA）简介1.1、基本概念：抗原：抗原是指进入人或动物机体后，可刺激机体免疫系统发生免疫应答，从而引起动物产生抗体或形成致敏淋巴细胞，并能和抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。抗体：是由抗原刺激动物的免疫系统后，由免疫系统产生分泌的能和相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。抗原抗体的基本特性：a、反应的特异性；b、反应的等比例性1.2、ELISA方法简介：ELISA属于标记免疫学技术的一种，1971年由荷兰和瑞典的学者提出，由于其操作过程简单易行并可以定量，从而使其在食品安全和卫生检测中得到了广泛的应用。目前市场上有多种基于ELISA方法开发的用于食品中抗生素检测的试剂盒产品。返回1.3、ELISA方法的原理基于抗原抗体反应的特异性和等比例性，以96孔的聚苯乙烯塑料微孔板（又称酶标板）为载体，在适当的技术条件下使抗原或抗体包被（吸附）在酶标板微孔的内壁上成为所谓的包被（固相）抗体或抗原，没有被吸附（游离）的抗原或抗体通过洗涤除去，然后直接加入酶标记抗体或抗原（或先加入适当的抗体或抗原与包被抗原或抗体反应后，再加入相应的酶标记抗体或抗原），形成酶标记的抗原—抗体复合物固定在微孔内，没有吸附的酶标记物洗涤去除，加入底物溶液于微孔中，复合物上的酶催化底物使其水解、氧化或还原成为有色的底物。在一定的条件下，复合物上酶的量（也反映了固定化的抗原抗体复合物的量）和酶产物呈现的色泽成正比，因此可以用分光光度计进行测定，从而计算出参与反应的抗原和抗体的量。这就是ELISA的原理。返回1.4、ELISA方法的分类ELISA可以分为直接法、间接法和夹心法等几种。直接法：直接法是指酶标抗原或抗体直接与包被在酶标板上的抗体或抗原结合形成酶标抗原—抗体复合物，加入酶反应底物，测定产物的吸光值，计算出包被在酶标上的抗体或抗原的量。见图2-17（a）间接法：是将酶标记在二抗上，当抗体（一抗）和包被在酶标板的抗原结合形成复合后，再以酶标二抗和复合物结合，通过测定酶反应产物的颜色可以（间接）反应一抗和抗原的结合情况，进而计算出抗原或抗体的量。见图2-17（b）夹心法：是先将未标记的抗体包被在酶标板上，用于捕获抗原，在用酶标的抗体与抗原反应形成抗体-抗原-酶标抗体复合物；也可以象间接法一样应用酶标二抗和抗体-抗原-抗体复合物结合，形成抗体-抗原-抗体-酶标二抗复合物，见图2-17（C）。前者称为直接夹心法，后者称为间接夹心法。返回ELISA原理及分类（图2-17）上述三种方法又可以分为竞争法和非竞争法。由于我公司的试剂盒产品绝大部分属于直接法中的竞争法。下面对直接法中的酶标抗原竞争法作重点说明。在进行测定时首先将包被了抗体的酶标板的微孔分为测定孔和对照孔，在对照孔中加入系列标准品溶液和酶标记物；在测定孔中同时加入酶标记物和非酶标抗原（通常来自于待测样品），酶标记物和样品互相竞争包被抗体的结合点，经过温浴后，没有结合到包被抗体上的酶标记物和样品经过洗涤去除。拍干后加入底物溶液，经温育后洗涤拍干，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值。其反应原理如（图2-18）返回竞争法ELISA原理（图2-18）如图所示.在进行测定时首先将包被了抗体的酶标板的微孔分为测定孔和对照孔，在对照孔中加入已知浓度的系列标准品溶液和酶标记物；在测定孔中同时加入酶标记物和待检样本（抗原），酶标记物和样品互相竞争包被抗体的结合点，形成酶标记的抗原—抗体复合物固定在微孔内，没有吸附的酶标记物通过洗涤去除，加入底物溶液于微孔中，复合物上的酶催化底物使其水解、氧化还原成为有色的产物。当测定孔内的样本不含抗原时，固相上的抗体将和酶标记物结合加入底物后呈色较深，当样本含有抗原时，样本中的抗原和酶标记物共同竞争抗体的结合位点，酶标抗原的比例越高，结合在固相抗体上的酶标抗原就越多，酶标抗原的比例越低，结合在固相上的抗体就越少，而在一定的条件下，复合物上酶的量（也反映了固定化的抗原抗体复合物的量）和酶产物呈现的色泽成正比，因此可以用分光光度计进行测定，从而计算出参与反应的抗原和抗体的量，从而进一步得知样本中抗原的多少。这就是竞争法ELISA的原理。測定孔EEEEE酶标记物底物溶液对照孔EEEEEEEEEEEEEEE酶标记物底物溶液參考液(不含抗原)EE樣本(含抗原)竞争法ELISA原理简述如图所示.在进行测定时首先将包被了抗体的酶标板的微孔分为测定孔和对照孔，在对照孔中加入已知浓度的系列标准品溶液和酶标记物；在测定孔中同时加入酶标记物和待检样本（抗原），酶标记物和样品互相竞争包被抗体的结合点，形成酶标记的抗原—抗体复合物固定在微孔内，没有吸附的酶标记物通过洗涤去除，加入底物溶液于微孔中，复合物上的酶催化底物使其水解、氧化还原成为有色的产物。当测定孔内的样本不含抗原时，固相上的抗体将和酶标记物结合加入底物后呈色较深，当样本含有抗原时，样本中的抗原和酶标记物共同竞争抗体的结合位点，酶标抗原的比例越高，结合在固相抗体上的酶标抗原就越多，酶标抗原的比例越低，结合在固相上的抗体就越少，而在一定的条件下，复合物上酶的量（也反映了固定化的抗原抗体复合物的量）和酶产物呈现的色泽成正比，因此可以用分光光度计进行测定，从而计算出参与反应的抗原和抗体的量，从而进一步得知样本中抗原的多少。这就是竞争法ELISA的原理。样本浓度的计算所获得的每个浓度标准溶液或样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（O标准）的吸光度值（B。）再乘以100%，即百分吸光度值。百分吸光度值（%)=(B/BO)/100%公式中B为样本溶液的平均吸光度值，B0为0PPb标准溶液的平均吸光度值。以克伦特罗浓度的半对数值为x轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图，（标准曲线如图一）相对应每一个样品中残留的克伦特罗的浓度可以从标准曲线上读出，在实际的计算中只需用酶标测出标准品和样品的吸光值，其他过程可通过专用的计算软件完成。返回2、ELISA试剂的组成2.1、完整的ELISA试剂盒应包含以下各组分：（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂，俗称酶标板）；（2）酶标记的抗原或抗体（酶标记物）；（3）酶的底物；（4）系列参考标准品（定量测定）；（5）酶标记物及样本的稀释液；（6）洗涤液；（7）反应终止液。返回2.2、ELISA试剂的作用2.2.1、固相载体：固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。可作ELISA中载体的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。ELISA载体的形状主要有三种：微量滴定板、小珠和小试管。以微量滴定板最为常用，专用于EILSA的产品称为ELISA板，国际上标准的微量滴定板为8×12的96孔式。2.2、免疫吸附剂：已包被抗原或抗体的固相载体，是ELISA方法中的核心试剂。返回2.3、酶标记物：即酶标记的抗原或抗体，是ELISA中最关键的试剂。良好的酶标记物应该是既保有酶的催化活性，也保持了抗体（或抗原）的免疫活性。酶标记物中酶与抗体（或抗原）之间有恰当的分子比例，在酶标记物中应尽量不含有或少含有游离的（未结合的）酶或游离的抗体（或抗原）。此外酶标记物还要有良好的稳定性。在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)和碱性磷酸酶(alkalinephosohatase,AP)。返回2.4、酶的底物2.4.1、HRP的底物HRP催化过氧化物的氧化反应，最具代表性的过氧化物为H2O2，其反应式如下：DH2+H2O2D+H2O上式中，DH2为供氢体，H2O2为受氢体。在ELISA中，DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物，以便作比色测定。常用的供氢体有邻苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基联苯胺(3,3‘,5,5’-tetramethylbenzidine,TMB)OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。OPD本身难溶于水，OPD·2HCL为水溶性。曾有报道OPD有致异变性，操作时应予注意。OPD见光易变质，与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定，须现配置现用。在试剂盒中，OPD和H2O2一般分成二组分，OPD可制成一定量的粉剂或片剂形式，片剂中含有发泡助溶剂，使用更为方便。过氧化氢则配入底物缓冲液中，有制成易保存的浓缩液，使用时用蒸馏水稀释。先进的ELISA试剂盒中则直接配成含保护剂的工作浓度为0.02%H2O2的应用液,只需加入OPD后即可作为底物应用液。TMB经HRP作用后产物显蓝色，目视对比鲜明。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有无致癌性等优点，因此在ELISA中应用日趋广泛。酶反应用HCL或H2SO4终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为450nm。2.4.2AP的底物AP为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenylphosphate,p-NPP)作为底物，可制成片剂，使用方便。产物为黄色的对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一时间。AP也有发荧光底物（磷酸4-甲基伞酮），可用于ELISA作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的比色法。返回2.5、洗涤液洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓度可在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。返回2.6酶反应终止液常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式ELISA中一般采用2mol/L。2.7参考标准品定量测定的ELISA试剂盒应含有制作标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可检测范围的4-5个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中。返回3、ELISA实验过程3.1试剂的准备按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA实验中应用蒸馏水或去离子水，。自配的缓冲液的PH应用pH计进行较正。从冰箱