鸡IL-2ELISA

鸡IL-2ELISA用途：1976年Morgan等发现小鼠脾细胞培养上清中含有一种刺激胸腺细胞生长的因子，由于这种因子能促进和维持T细胞长期培养,称为T细胞生长因子(Tcellgrowthfactor,TCGF),1979年统一命名为白细胞介素2(interleukin2,IL-2)。　1.IL-2的产生IL-2主要由T细胞或T细胞系产生。　(1)CD4阳性或CD8阳性T细胞:有丝分裂原刺激CD4阳性或CD8阳性T细胞亚群均可产生IL-2同种异体抗原主要刺激CD4阳性T细胞分泌IL-2。PBMC、脾脏、淋巴结和扁桃腺中的T细胞受到刺激后都能产生IL-2。在小鼠Th细胞中，只有Th1亚群可产生IL-2。　(2)T细胞肿瘤细胞系或白血病细胞系:人和动物某些T细胞白血病细胞系或肿瘤细胞在有丝分裂原、钙离子载体(如A23187)或PMA刺激下可产生高水平的IL-2。如长臂猿T细胞系MLA144可自发产生IL-2,小鼠胸腺瘤细胞系EL-4和人Jurkat细胞静止状态不合成和分泌IL-2,刺激后可分泌高水平的IL-2。　(3)T淋巴细胞杂交瘤:T淋巴细胞杂交瘤123,FS6-14.13,HT-24A等在ConA刺激下产生IL-2。　(4)应用基因工程技术制备:1983年Taniguchi等从ConA刺激的Jurkat白血病T细胞中克隆成功IL-2cDNA，并在大肠杆菌中得到高水平的表达。目前应用基因工程技术所制备和纯化的IL-2已用于临床治疗某些肿瘤和其它疾病。　2.IL-2的分子结构和基因人IL-2含有133氨基酸残基，分子量为15.5kDa。天然IL-2在N端含有糖基，但糖基对IL-2的生物学活性无明显影响，等电点在6.6～8.2。IL-2分子含有3个半胱氨酸，分别位于第58、105和125位氨基酸，其中58位与105位半胱氨酸之间所形成的链内二硫键对于保持IL-2生物学活性起重要作用。在IL-2基因产物的提纯和复性过程中，如二硫键配错或分子间形成二硫键都会降低IL-2的活性。现已有应用点突变，将第125号位半胱氨酸突变为亮氨酸或丝氨基，使只能形成一种二硫键，保证了在IL-2复性过程的活性。还有报道用蛋白工程技术生产新型rIL-2，将IL-2分子第125位半胱氨酸改为丙氨酸,改构后IL-2比活性比天然IL-2明显增加。人IL-2基因定位于第4号染色体，长约5kb，由４个外显子和3个内含子组成。人和小鼠IL-2基因DNA序列有63％同源性。本试剂盒用于定量检测鸡组织匀浆中的IL-2的浓度。原理：本试剂盒采用双抗夹心ELISA法。抗鸡IL-2单抗包被于酶标板上，鸡标本中的IL-2会与单抗结合。加入生物素化的抗鸡IL-2（二抗），它将与结合在单抗上的鸡IL-2结合而形成免疫复合物，未结合的将被洗去。辣根过氧化物酶标记的Streptavidin将与二抗的生物素结合，多余的物质会被洗掉。加入TMB显色。鸡IL-2的浓度与OD(450nm)成正比。试剂盒组成：酶标板(CoatedWells)48wellsAnti-ChookIL-2Biotin1vial浓缩洗涤液(100X)(WashingConcentrate)5ml标准品(Standards)1vial显色液(TMBSubstrate)6ml标准品稀释液(StandardDiluent)7ml终止液(StopSolution)6ml浓缩酶联物（HRP）1vial酶联物稀释液(HRPDiluent)7ml生物素稀释液(BiotinDiluent)7ml需要但未提供的材料1.可在450nm处进行读数的酶标仪；2.能精确吸取10-200µL的移液器；3.可调多道（8）移液器（50－200µL）；4.供可调多道移液器使用的试剂存放槽；5.洗瓶或洗板机；6.蒸馏水或去离子水；7.1升的圆柱形量筒；8.移液器：1和（10或25mL）；9.移液器枪头；10.纸巾；11.计时器，用以监控温育步骤；12.处理池和消毒剂（例如：0.5%次氯酸钠,10%家用漂白水）；注意事项:1.严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。2.洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入HRP或底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。3.消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。4.底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。5.避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。6.在储存和温育时避免强光直接照射。7.平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。8.任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。9.不能使用过期产品。10.如果可能传播疾病，所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。保存：贮藏于2-8°C。样品：在此检测中，可使用组织匀浆样品。准备工作：1.浓缩洗涤液(100X)用双蒸水稀释成1X（至500ml）。2.标准品用1ml标准品稀释液复溶。得到2000pg/ml的高浓度标准品。高浓度标准品可保存于-20°C。3.将2000pg/ml的高浓度标准品稀释成一组标准品，如：1000,500,250,125,62.5,0pg/ml。4.配制1xHRP：一支HRP加入6ml酶联物稀释液，混匀。1xHRP最好在临用前15分钟配制。5.配制1xBiotin：一支BiotinantiChookIL-2加入6mlBiotin稀释液，混匀。1xBiotin最好在临用前15分钟配制。操作步骤：试剂盒应平衡至室温（20-25°C）再试验。取出所需反应板。z临用前15分钟配制工作液1.加入100ul标准品(Standards)、100ul标本于相应反应板孔中。2.轻轻混匀30秒，封住板孔，37°C温育60分钟。3.洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板（每孔内加入350ul洗涤液），并去除水滴（在厚叠吸水纸上拍干）；反复洗涤5次。4.每孔加入100ul1xBiotin。轻轻混匀30秒，封住板孔，37°C温育60分钟5.洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板（每孔内加入350ul洗涤液），并去除水滴（在厚叠吸水纸上拍干）；反复洗涤5次。6.每孔加入100ul1xHRP。轻轻混匀30秒，封住板孔，37°C温育30分钟7.洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板（每孔内加入350ul洗涤液），并去除水滴（在厚叠吸水纸上拍干）；反复洗涤5次。8.每孔加入100ulTMB显色液，轻轻混匀10秒，37°C暗处温育15±10分钟。9.每孔加入100ul终止液（StopSolution)。轻轻混匀30秒；30分钟内在450nm处读OD值。以OD值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据样品的OD值可在标准曲线上查出其浓度。举例：00.20.40.60.811.2050010001500Conc.ofchookIL-2(pg/ml)OD(450nm)注意事项：1.作标准曲线时，要扣除标准品稀释液造成的本底；如果标本用标准品稀释液稀释，也要扣除标准品稀释液造成的本底，如果标本未用标准品稀释液稀释，标本不需扣除标准品稀释液造成的本底。2.生物素(BiotinantiChookIL-2)和浓缩酶联物(HRP)用前应离心，使液体位于管底。