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重庆医科大学硕士学位论文左旋丁基苯酞抑制氧糖剥夺/复氧后小鼠脑胶质细胞内NF-κB的激活及机制姓名：邓杉杉申请学位级别：硕士专业：神经病学指导教师：罗勇20080501左旋丁基苯酞抑制氧糖剥夺/复氧后小鼠脑胶质细胞内NF-κB的激活及机制作者：邓杉杉学位授予单位：重庆医科大学相似文献(10条)1.会议论文李呼伦.钟照华.李国忠.金连弘大鼠脑缺血后胶质细胞向树突状细胞转化的研究2003本文探讨了缺血脑组织中树突状细胞(DC)的来源.方法：用线栓方法封闭大鼠右侧大中动脉制作动物模型.用免疫组化方法,检测脑缺血1h到第6天时,缺血脑DC(OX62+)的存在,以及胶质细胞/巨噬细胞(OX42+)转化成DC(OX62+),同时检测活化后的DC样细胞表达MHC-Ⅱ类分子的水平.结果：脑缺血半球和假手术半球比较,在12小时DC数量增加(P＜0.001).在脑缺血组中,缺血脑半球与非缺血脑半球比,DC的数量也增多(P＜0.001).脑缺血第6天缺血组与假手术组进行比较,DC表达MHC-Ⅱ(OX62+OX6+)显著升高(P＜0.001).脑缺血半球在1h到第6天,OX42+转变成0X62+0X42+细胞逐渐增加,脑缺血第6天脑缺血半球与非缺血半球比P＜0.001.脑缺血损伤面积与以每100mm2脑组织片为单位的OX62+数量呈正相关(R2=08914P＜0.001).结论：脑缺血后,脑缺血组织中DC的数量增加,DC数量增加与脑伤面积呈正相关,提示DC参与了脑缺血过程,大鼠脑缺血后从胶质细胞向DC样细胞转化是脑内DC的来源之一.2.学位论文耿进霞胶质细胞谷氨酸转运体亚型GLT-1调制对大鼠脑缺血预处理脑保护作用的影响2007脑缺血疾病是严重危害人类健康的疾病之一。神经细胞对缺血性危害极为敏感，如果缺血时间较长，神经细胞会大量死亡，即使恢复血液供应，神经细胞也难以再生，甚至会留下严重的后遗症。随着对脑缺血疾病研究的深入，脑缺血耐受(brainiscIlenlictolerailce，BIT)现象越来越普遍受到关注。实验发现，给动物突然造成较严重的脑缺血后，海马CAl区的神经元会大量死亡。若在此之前，预先给动物造成轻微、短时、不至于引起神经元死亡的脑缺血，间隔一定时间后，再给动物造成较严重的、通常会引起大量神经元死亡的脑缺血，此时海马CA1区的神经元则基本不死亡，即神经元对缺血性损害产生了抵抗力，这一现象被称为脑缺血耐受。预先给予的轻微、短时脑缺血称为脑缺血预处理(cerebralischemicpreconditioning，CIP)。阐明脑缺血预处理脑保护作用的发生机制，对临床上研究、开发提高神经元对缺血缺氧耐受性的治疗方法具有重要意义。各种疾病引起的脑组织缺血、缺氧均可引起神经元能量代谢障碍，抑制Na'+/K'+依赖式ATP酶的活动，使细胞外K'+浓度明显增高，Na'+浓度相应降低，导致神经元去极化，引起兴奋性神经末梢释放谷氨酸；此外，细胞外高K'+能够逆转高亲合力谷氨酸转运体的活动，把谷氨酸从细胞内转运至细胞外。这些原因引起细胞外谷氨酸等兴奋性氨基酸增多。这些增多的谷氨酸与神经细胞膜相应的受体结合，引起Na'+、Ca'2+内流以及细胞内Ca'2+释放，导致Na'+、Ca'2+超载，进而使神经细胞死亡。因此，将这些氨基酸称为兴奋性神经毒素。降低脑缺血时细胞外液中谷氨酸的浓度，减少其与突触后膜特异性受体的结合，是防治其兴奋性毒性作用、减轻缺血时神经元损伤的重要手段。兴奋性氨基酸转运体(excitatoryaminoacidtransports，EAATs)是调控脑内细胞外液谷氨酸浓度的重要机制。其中星形胶质细胞谷氨酸转运体亚型GLT-1在终止谷氨酸能神经传递，维持细胞外液谷氨酸浓度处于正常水平方面发挥重要作用。一些研究对星形胶质细胞GLT-1在缺血缺氧耐受中的作用给予了关注。例如，Douen等研究表明，皮层扩散性抑制预处理可以下调星形胶质细胞谷氨酸转运体(EAAT1和EAAT2)的表达，防止缺血引起的谷氨酸逆转运；Romera等应用离体(invitro)模型发现，缺血或缺氧预处理可以使谷氨酸转运体表达增加。这些结果提示GLT-1可能与脑缺血耐受有关。但星形胶质细胞GLT-1在整体情况下(invivo)是否参与CIP的脑保护作用?调制GLT-1是否可增强脑细胞对缺血性损害的耐受性?等尚未见报道。因此，本实验应用大鼠全脑缺血模型、GLT-1抑制剂Dihydrokainate(DHK)、GLT-1反义及正义寡核苷酸，在整体水平探讨调制GLT-1对脑缺血耐受诱导的影响，为阐明GLT-1在脑缺血耐受形成中的作用提供实验依据。1DHK抑制GLT-1的功能阻断CIP诱导的脑缺血耐受应用大鼠四血管闭塞(4-vesselOCClusion，4VO)全脑缺血模型，观察GLT-1特异性抑制剂DHK对CIP脑保护作用的影响，探讨GLT-1在脑缺血耐受中的作用。将96口、凝闭双侧椎动脉2d后的Wistar大鼠随机分为8组：①sham组(n=6)：只暴露双侧颈总动脉，不阻断血流；②CIP组(n=6)：夹闭双侧颈总动脉3min；③脑缺血打击组(n=6)：夹闭双侧颈总动脉8min；④CIP+脑缺血打击组(n=6)：夹闭双侧颈总动脉3min作为CIP，再灌注2d后再夹闭双侧颈总动脉8min；⑤双蒸水组(n=6)：右侧脑室注射双蒸水20μl；⑥DHK组(n=30)：右侧脑室注射DHK溶液20μl，根据DHK的剂量进一步分为10、100、200、500和1000nmol5个亚组，每组6只动物；⑦DHK+CIP组(n=18)：右侧脑室注射DHK溶液20μl，20min后夹闭双侧颈总动脉3min，根据DHK的剂量进一步分为10、100和200nmol3个亚组，每组6只动物；⑧DHK+CIP+脑缺血打击组(n=18)：右侧脑室注射DHK溶液20μl，20min后夹闭双侧颈总动脉3min，2d后夹闭双侧颈总动脉8min。根据DHK剂量不同分为10、100、200nmol3个亚组，每组6只动物。以上各组动物于sham手术、侧脑室注射或末次脑缺血后7d断头取脑，常规脑组织切片(5μm厚)，硫堇染色，光学显微镜下观察海马CA1区组织学形态，确定锥体神经元迟发性死亡(delayedneuronaldeath，DND)情况。计数海马CA1区每1mm区段内细胞膜完整、胞核饱满、核仁清晰的锥体细胞数目，每张切片双侧海马各计数3个区段取平均数为神经元密度(Neuronaldeilsity,ND)。根据以下标准确定组织学分级(Histologicalgrade，HG)：0级，无神经元死亡；Ⅰ级，散在神经元死亡；Ⅱ级，成片神经元死亡；Ⅲ级，几乎全部的神经元死亡。结果发现，4VO过程中，大鼠翻正反射消失，瞳孔散大，脑电波频率变慢，波幅逐渐变小甚至成等电位线，说明产生了全脑缺血。硫堇结果显示，Sham组和CIP组大鼠海马CA1区无明显的DND，HG为0～Ⅰ级，ND值分别为208.25±5.97和202.93±4.32。脑缺血打击组大鼠海马CA1区出现明显的DND，与sham组和CIP组相比，HG(Ⅱ～Ⅲ级)明显升高(P0.01)，ND值(45.86±21.93)显著降低(P0.01)。CIP+脑缺血打击组海马CA1区DND不明显，与脑缺血打击组相比，HG(0～Ⅰ级)明显降低(P0.01)，ND值(208.07±5.87)显著升高(P0.01)，表明CIP可以诱导海马CA1区神经元产生缺血性耐受，对抗缺血打击引起的DND。右侧脑室注射双蒸水后海马CA1区组织形态与Sham组和CIP组基本一致。单纯侧脑室给予DHK组中，10、100、200nmol剂量组海马CA1区神经元少量死亡，三组的HG均为Ⅰ级，ND值分别为172.76±17.31、162.64±6.12和155.43±9.82；而500、1000nmol剂量组的HG分别为为Ⅱ级和Ⅲ级，ND值分别为105.35±3.84和6±1.39；与10、100、200nmol组相比，HG和ND的变化具有显著性(P0.05)，表明大剂量的DHK可引起显著的海马CA1区锥体神经元死亡。因此，以下各组中，仅观察DHK10、100和200nmol的影响。DHK+CIP组中海马CA1区组织形态与Sham组和CIP组基本一致(10、100和200nmol组HG均为为0～Ⅰ级，ND值分别为192.15±6.25、188.65±3.90和191.35±3.88)。DHK+CIP+脑缺血打击组中，大鼠海马CA1区出现了显著的DND，随着DHK剂量的增加，其HG级逐渐升高(10nmol组为Ⅰ级，100nmol组为Ⅰ～Ⅱ级，200nmol组为Ⅲ级)，ND逐渐下降(10nmol组为160.87±13.55，100nmol组为117.07±10.11，200nmol组为4.87±2.02)；与CIP+脑缺血打击组相比，上述HG和ND的变化具有显著性(P0.01)；此外，与单独DHK组相比，DHK+CIP+脑缺血打击组的DHK的量效曲线明显左移，并且斜率变陡。以上结果表明，GLT-1特异性抑制剂DHK可剂量依赖性地阻断CIP抗脑缺血打击的作用，提示GLT-1参与CIP诱导的脑缺血耐受。2GLT-1反义寡核苷酸抑制GLT-1表达减弱CIP抗脑缺血打击的作用应用GLT-1反义寡核苷酸(antisenseoligodeoxynucleotides，AS-ODNs)抑制GLT-1蛋白的表达，观察其对CIP抗脑缺血打击作用的影响，进一步探讨GLT-1在脑缺血耐受中的作用。以上结果显示，单纯侧脑室注射AS-ODNs可引起海马CAl区GLT-1表达下调，但不引起明显的DND；而预先侧脑室注射AS-ODNs可减弱CIP对海马CA1区锥体神经元的保护作用。这些结果表明AS-ODNs通过抑制GLT-1表达从而减弱了CIP对海马CA1区锥体神经元的保护作用，进一步证实了GLT-1在CIP对脑缺血耐受诱导中的作用。3GLT-1正义寡核苷酸上调GLT-1的表达增强脑对缺血打击的耐受应用GLT-1正义寡核苷酸(senseoligodeoxvnucleotides，S-ODNs)上调GLT-1的表达后，观察海马CA1区锥体神经元对脑缺血打击的耐受情况，进一步确定GLT-1在脑缺血耐受中的作用。4结语(1)谷氨酸转运体GLT-1抑制剂DHK通过抑制GLT-1的功能而减弱了CIP对海马CA1区锥体神经元的保护作用；(2)侧脑室注射谷氨酸转运体GLT-1AS-ODNs可抑制GLT-1的表达，同时减弱了CIP对海马CA1区锥体神经元的保护作用；(3)侧脑室注射GLT-1S-ODNs上调GLT-1表达的同时，增强了海马CA1区锥体神经元对脑缺血打击的耐受性，产生了与CIP相同的效果。(4)以上结果表明GLT-1参与了CIP诱导的BIT。3.期刊论文李呼伦.钟照华.李国忠.金连弘大鼠脑缺血后胶质细胞向树突状细胞转化的研究-细胞与分子免疫学杂志2002,18(6)目的探讨缺血脑组织中树突状细胞(DC)的来源,以其及是否参与脑缺血损伤的过程.方法用线栓方法封闭大鼠右侧大脑中动脉制作动物模型.用免疫组化染色法,检测脑缺血1h到第6天时,缺血脑组织中DC(OX62+)的存在,以及胶质细胞/巨噬细胞(OX42+)转化成DC(OX62+)的情况.同时检测活化后的DC样细胞表达MHC-Ⅱ类分子的水平.结果缺血脑半球和假手术的脑半球相比较,在12hDC的数量明显增加(P0.001).在脑缺血组中,缺血脑半球与非缺血脑半球相比较,DC的数量也增多(P0.001).脑缺血第6天,缺血组与假手术组进行比较,DC表达MHC-Ⅱ类分子(OX62+OX6+)显著升高(P0.001).缺血脑半球在1h到第6天,OX42+的细胞转变成OX62+OX42+的细胞逐渐增加,第6天缺血脑半球与非缺血脑半球相比较显著增多(P0.001).脑缺血损伤的面积与以每100mm2脑组织切片为单位的OX62+细胞的