TALENandCRISPR

北京唯尚立德生物技术有限公司庄峰锋博士划时代的靶向基因操作技术-TALEN和CRISPR/Cas9北京唯尚立德生物科技有限公司庄峰锋博士技术总监兼执行董事•清华大学工程物理学士和生物化学硕士•美国南加州大学（USC）发育生物学博士•美国哈佛大学基因重组博士后•2011年回国创办唯尚立德和管理苏州吉诺瑞太上有立德，其次有立功，其次与立言提供专业靶向基因敲除、编辑服务和产品•Background•Transcriptionactivator-like(TAL)effector•CRISPR/Cas9•High-ThoughtScreeningbysiRNA•DiscussionOutline无论研究什么生物现象，都需要做一件事：改变基因1）Lossfunction：降低基因或删除基因2)Givefunction:提高基因的表达在逻辑上，从必要性和充分性方面阐明基因功能生物学家的梦想：随心所欲地操作基因生物学家的梦想：随心所欲地操作基因划时代的基因靶向操作技术：TALE与CRISPR/Cas9使靶向操作不再是梦我们不再大海捞针！！！经典基因操作：1.Genetrap:化学诱变；转座子--------海量的筛选+goodLuck2.同源重组：一般物种几率低,10-6；EScell10-2难！突破性的发现：RNAi-Knockdown;不完全敲除，临时性充满梦想却幻灭的ZFN：•难以完全找到匹配的3连子锌指；•Off-target严重美国加州大学DaveSegal教授说：“Withzincfingers,wehavetolettheDNAtelluswherewetarget”完美基因靶向操作：识别特异DNA序列的蛋白+操作DNA的酶TALE的发现并迅速成为科技最前沿完美基因靶向操作：识别特异DNA序列的蛋白+操作DNA的酶•1989年，植物病原体黄单胞菌属（Xanthomonasspp.）avrBs3基因被克隆。•2009年TALeffector氨基酸序列与核酸靶序列的密码被破译•2011年8月，NatureBiotechonlogy同时发表4篇TALEN基因敲除文章及一篇综述TALE：transcriptionactivatorlikeeffectorTALE的密码和原理DNARNAProtein中心法则密码的延伸：Bochal.Science.2009BochJ.andBonasU.,2010HD:CNG:TNI:ANN:G/ARVD:12,13,repeat-variablediresiduesTALE的结构DongDengetal.,Science5January2012,121:5670TALE的主要两个应用1.TALEN（transcriptionactivator-like(TAL)effectornucleases）识别任意特定核酸靶序列的重组核酸酶2.TALEA（transcriptionactivator-like(TAL)effectoractivator）或TALE-TF激活体内任意目标基因的转录激活因子TALEN-神奇的基因剪刀TALEN两部分组成：识别特异DNA序列的TALE和内切酶FOKI有了TALEN,想在哪里剪断DNA就在哪里剪。DoubleStrandBreaks(DSB)Repair（DNA双链断裂）细胞内的DNA损失修复方式：1.Nonhomologousend-joining(NHEJ)-Loseofseveralbases2.Homologousrecombination(HR)-InvolvinganexchangeofstrandsbwseparateDNAmolecules(indels)TemplateDoublestrandbreaks(DSB)TALEN-神奇的基因剪刀细胞内基因组DNA被TALEN剪切后，诱发DNA损伤修复机制。细胞可以通过NHEJ（Non-homologousEndJoining）修复DNA，在此修过程中或多或少地删除或插入了一定数目的碱基，造成移码，形成目标基因敲除突变体。TALEN敲除基因的效率大约为20%，从1%-30%。最好的TALEN达50%TALEN-神奇的基因剪刀实现基因敲除用于同源重组的TALEN：提高同源重组100-1000倍TALEN剪切DNA产生DSB后，若能提供同源修复模板，细胞可通过同源重组方式修复DNA，因此可以对内源DNA做更精细的操作，如点突变（磷酸化位点）、保守区域替换、N端或C端加标记（GFP、HA、Flag。。。。。。）等等。TALEN-神奇的基因剪刀TALEN的应用：模式生物的基因敲除InvitroTranscriptionMicroinjection基于EScel和同源重组的基因敲除TALEN的基因敲除2-6月3月3月5-10天3月TALEN的应用：模式生物的基因敲除-Rat基因敲除TALEN靶点位置TALEN敲除大鼠的几率NaturebiotechnologyV29:695TALEN的应用：人类IPS干细胞的基因修饰TALEN极大地提高了同源重组的效率NaturebiotechnologyV29:731TALEN的应用：HIV的治疗-唯尚立德合作例子1流水细胞分离检测敲除效率TALEN的应用：无痕的植物基因敲除农杆菌Ti载体感染方法：将TALEN构建到中间载体中，通过Ti载体介导转染插入植物基因组中，然后表达目标蛋白-TALEN，TALEN剪切DNA，造成突变体。最后通过交配将TALEN去除，达到无痕基因敲除的目的TALEN的应用：无痕的植物基因敲除原生质体愈伤组织植株转染或电转TALEN质粒筛选基因敲除的愈伤组织原生质体培养植株方法TALEN的应用：水稻基因敲除-抗病水稻NatureBiotechnology2012V30:390TALEN的应用：水稻基因敲除-抗病水稻NatureBiotechnology2012V30:390TALEN的应用：GenesKOinriceandBrachypodiumShanQetal.MolPlant.2013Jan22.[Epubaheadofprint]GeneNameTALENIDMutagenesisFrequency（protoplasts）MutagenesisFrequency(Callus)OsDEP1T-OsDEP14%34.80%OsBADH2T-OsBADH2b8%26.70%OsCKX2T-OsCKX214%61.70%BdSMC6T-BdSMC68.30%13.30%BdSPLT-BdSPL10%100%BdSBPT-BdSBP8.00%52.90%BdCOI1T-BdCOI14.00%61.10%BdRHTT-BdRHT05.90%ShanQetal.MolPlant.2013Jan22.[Epubaheadofprint]TALEN的应用：GenesKOinriceandBrachypodium将识别特异DNA序列的TALE与转录激活因子VP64融合，表达的融合蛋白结合启动子附近的特异DNA序列，并通过VP64激活区域与PolII结合，激活基因的转录，提高了内源目标基因的表达。TALEA-人工转录因子TALEA-人工转录因子TALEA-人工转录因子-植物基因的激活TALEA激活表达辣椒叶子Bs3gene用表达TALEA的油菜黄单胞菌的上清液感染辣椒叶子。NucleicAcidsRes.39,e82(2011)质粒骨架AvrHah1Bs3-TALEA癌细胞迁移相关基因的筛选-北京大学席建忠教授唯尚立德的合作伙伴-例子2siRNA激酶文库筛选：负筛选-lossfunctionTALEA的验证与筛选：正筛选-givefunction合成80个候选基因的TALEA，提高细胞内基因的表达，检测癌细胞迁移结果是否和siRNA筛选相反。共有80个激酶基因影响癌细胞的迁移唯尚立德的合作伙伴-例子2首批合成的20个激酶TALEA,其中有13个表现为与siRNA的结果相反-1012345678RelativeMigrationSpeedTale-VPsiRNATALE应用展望-TALEX将识别特DNA序列的TALE与不同的蛋白酶融合，实现不同的靶向基因操作的应用：1.抑制基因表达---TALER2.启动子附近的甲基化---TALEM3.特定序列的重组酶---TALER4.光控表达的TALEN或TALEA---TALEL5.。。。。。。。TALE常见组装技术时间花费长6步质粒的构建：6X3-6天=18-36天。不包括每步的测序等待时间。工作量巨大16个质粒。活性并不保证唯尚立德的大规模TALE制备技术优势：不同于传统的酶切连接方法，我们的方法利用在固相表面实现快速合成，实现快速、高效大规模制备TALE,一天可以合成上百条TALERef:ZhaoWangetal,AnIntegratedChipfortheHigh-throughputManufactureofTALEffectors.Angew.Chem.Int.Ed.2012(Accepted)唯尚立德的TALEN合成时间表－TimelineDay1Day2Day3•设计TALE靶点位置•准备组装单元•纯化并调整组装单元浓度•组装TALE•构建TALEN/TALEA质粒•转染质粒•PCR鉴定阳性克隆•提取质粒并送测序唯尚立德的TALEN活性检测方法酶切法LuciferaseSSA法TGTTGGCTTTGATGCTGTTACTGGAgaattcACTGTAAGTTAACCTAGTTCGGGCCEcoRIMutantWild-type0102030405060012345678910唯尚立德的TALEN活性检测方法TALEN突变率Luciferase活性比值两种检测方法的关系图唯尚立德设计TALEN的活性10对家蚕基因的TALEN活性检测唯尚立德设计TALEN的活性50%0%15%TwoGeneTALENefficiencyinhumanIPScellMeasurebySURVEYORMutationDetectionKitsCat基因的TALEN与靶点:TALENCat-L1:TGCCTAACCAATGGAGCAAACAATGTATAGTGTCTAGATGGCTTTGGAAAGCAACat-L2:TAACCAATGGAGCAAACAATGTATAGTGTCTAGATGGCTTTGGAAAGCAA报道质粒靶点DNA序列LUC-WTreporter:TTGCCTAACCAATGGAGCAAACAATGTATAGTGTCTAGATGGCTTTGGAAAGCAATLUC-Mureporter:TTGCCTAACCAATGGACCAAACAATGTATAGTGTCTAGATGGCTTTGGAAAGCAAT135.618.3051015202530354045NCLUC-WtLUC-MuTALEN活性TALENCat-L1对WTandMutantDNA剪切活性128.512.20510152025303540NCCat-L2(LUC-Wt)Cat-L2(LUC-Mu)TALEN活性TALENCat-L2对WTandMutantDNA剪切活性TALEN的高特异性Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat(CRISPR)/Cas9是细菌和古细菌一种不断进化适应的免疫防御机制。CRISPR/Cas9利用一段小RNA来识别并进行有效的靶向DNA剪切。•AProgrammableDual-RNA–GuidedDNAEndonucleaseinAdaptiveBacterialImmunity–Science,2012,337:816-821•RNA-GuidedHumanGenomeEngineeringviaCas9–Science,2013,online•MultiplexGenomeEngineeringUsingCRISPR/CasSystems–S