03军团菌检验标准方法学研究-朱庆义XXXX1013

军团菌检验标准方法学研究朱庆义广州金域医学检验中心[e-mail]内容提要•研究背景•军团菌和军团菌病简介•军团菌病实验室诊断现状•军团菌检验标准方法学的建立研究背景•1976年在美国费城，首次发现军团菌病暴发流行；•1982年在我国南京首次发现军团菌病例；•《军团菌检验方法》，目前已有各种国际标准：ISO11731:1998和11731-2:2004，WHO标准，美国CDC-2005和EPA822-R-001标准，英国NHS系列国家标准，澳大利亚/新西兰AS/NZS-5024-2005标准等；•我国仅有一个卫生部军团菌诊断行业标准（WS195-2001）。军团菌•军团菌是一种兼性胞内致病菌，革兰阴性，有极端鞭毛，生长时需L-半胱氨酸和铁盐，细胞壁中有支链脂肪酸，可利用氨基酸作为能量来源，不发酵碳水化合物，DNAG+C含量39~43%；•广泛存在于天然淡水或人工水域中，在阿米巴体内寄生；•目前已知军团菌属有58个种70多个血清型。军团菌病•军团菌病主要是由嗜肺军团菌引起的一种以肺炎为主的全身性疾病；•可感染人巨噬细胞，在其胞内繁殖和杀死人巨噬细胞；•主要通过空气中气溶胶传播，中央空调冷却塔水系统是主要传染源；•临床分两种类型：军团菌肺炎（Legionellapneumonia）和庞蒂亚克热（Pontiacfever）。军团菌病实验室诊断现状•细菌分离培养是金标准；•军团菌尿抗原检测、血清抗体（IgG、IgM）；•军团菌核酸检测：包括各种PCR试验、探针杂交、基因测序等；•国内至今还没有一种经SFDA批准、可供临床实际应用的军团菌检测试剂盒；•进口试剂价格昂贵，不适用。军团菌检验标准方法学的建立•标本采集、运送及其处理原则•军团菌分离培养•生化试验鉴定•细胞脂肪酸成分分析检测军团菌•5S、16SrRNAPCR快速检测军团菌•嗜肺军团菌毒力基因分型检测•嗜肺军团菌AFLP分型检测•PCR酶切分型快速检测军团菌和嗜肺军团菌（巢式PCR-酶切分型快速检测军团菌）•实时荧光定量PCR快速检测军团菌（荧光PCR熔解曲线法检测军团菌）•荧光原位杂交检测军团菌1、标本采集、运送及其处理原则•标本采集、运送（环境样本和临床样本）；•标本浓缩处理：膜过滤法；离心法；热富集法。•杂菌去除：酸处理：0.2mmol/LHCL-KCL酸缓冲液；热处理：50℃水浴，30min。2、军团菌分离培养•军团菌运送增菌培养基；•军团菌选择性分离培养基（BCYEα-DGVPC）；•分离培养程序：接种：接种50μl经处理的样品，用涂布棒或接种环将均匀涂布。培养：于2.5%~5%CO2培养箱，36±1℃，培养至3~7d。菌落计数：从第2天开始，每天记录平板上疑似菌落的数量。3、军团菌生化试验鉴定•军团菌生化试验包括菌落挑丝（Vis）、培养基棕色色素（Bro）、菌落自发荧光（Cflu）、培养基荧光（Flu）、BCP（溴甲酚紫）斑点试验、触酶（Cat）、氧化酶（Oxi）、明胶液化（Gel）、马尿酸水解（Hip）、硝酸盐还原（Nit）、动力（Mob）等。•在BCYEα平板上纯培养3-5d，挑取新鲜菌落进行生化试验。4、细胞脂肪酸成分分析检测军团菌•试验方法：细胞脂肪酸成分分析采用美国MIDI公司Sherlock全自动细菌分析系统，参照MIDI标准化操作程序：刮取BCYEα平板上培养72h新鲜菌落，抽提脂肪酸，用HP6890气相色谱仪测定脂肪酸甲酯（fattyacidmethylester，FAME），参考DiogoA方法，统计软件SPSS11.5，完成聚类分析。•试验结果：对本实验室分离的153株军团菌和36株标准军团菌参考菌株，按Sherlock全自动细菌分析系统相似指数≥0.6作为种属鉴定的依据。分离的军团菌株可分为8个群（如下图）。5、5S、16SrRNAPCR快速检测军团菌•5SrRNA：扩增片段113bpLP1-F5’-GGCGACTATAGCGATTTGGA-3’LP1-R5’-TCCTGGCGATGACCTACTTT-3’•16SrRNA：扩增片段386bpLP2-F5’-AGGGTTGATAGGTTAAGAGC-3’LP2-R5’-CCAACAGCTAGTTGACATCG-3’•采用5S、16SrRNA引物，进行PCR试验，其敏感性可检出1~10个细菌中DNA含量。通过对57份中央空调冷凝塔水样，53例呼吸道感染病源不明的非典型肺炎患者临床样本认为该方法是一种可靠、有效的方法。6、嗜肺军团菌毒力基因分型检测•方法：根据嗜肺军团菌65-Kbp毒力岛（PAI）基因组核苷酸序列设计12对毒力基因引物，采用常规PCR试验方法检测军团菌的12个毒力基因；下表为军团菌标准菌株PAI检测结果。细菌类型菌株数PAI毒力基因组阳性数IraAIraBMimPIvrAIvhBIvhDCpxRCpxADotARpoBIcmCIcmD嗜肺161616915111416151661116致病性20111241187623864非致病性10564424555655致病性军团菌：嗜肺、菲氏、博氏、杜氏、麦氏、长滩、沃氏、哈氏、马氏、海伦山、橡树岭、茴芹等20种。非致病性军团菌：圣灵、詹姆斯敦、卫生十字、彻氏、施氏、红光、费氏、溶解、昆氏、阿德莱德等10种。军团菌类型（菌株数）军团菌PAI毒力岛基因组阳性数IraAIraBMimIraAIraBMimIraAIraBMimIraAIraBMim嗜肺（167)160166133138106147145155128162159164菲氏（41）393722302328322922383140长滩（12）121212121212121212121212橡树岭（6）665666665666戈氏（7）776776766766海伦山（3）220121011222嗜肺（4）病人4424444444447、嗜肺军团菌AFLP分型检测•方法：参考EWGLI-AFLP分型方法，对本室分离的116株嗜肺军团菌进行分型检测，对同一来源的多个菌株，如扩增条带一致，则鉴定为同一菌株。AFLP多态性数据按照Nei和Li的方法：包括（1）限制性酶切连接反应；（2）PCR反应；（3）凝胶电泳；（4）数据分析等四步；然后用NTSYS-pc软件进行UDPGA聚类分析。•结果：116株初分离的嗜肺军团菌，经AFLP技术对同一来源菌株的扩增图谱进行比较，鉴定得到41个不同菌株。该41株不同菌株经AFLP分析，都扩增得到带型清晰的DNA指纹图谱。经Checkcross软件对AFLP扩增图谱进行分析，共分为31个不同的AFLP型，见下图（基于dice系数及UDPGA方法的嗜肺军团菌AFLP遗传关系树状图）。41株嗜肺军团菌的AFLP分型图8、PCR酶切分型快速检测军团菌•引物设计：在16SrRNA基因226bp发现有一嗜肺军团菌特有的酶切位点设计引物。•PCR反应：•酶切分型：（HpyCH4Ⅲ酶或Taal）•结果分析：嗜肺军团菌：180bp和46bp两个条带；菲氏、昆氏、伯明翰、布吕嫩、兰斯格、圣灵湖和多纳尔特军团菌：153bp和73bp两个条带；其他军团菌仍为226bp条带。引物Ⅰ:Leg386F5’AGGGTTGATAGGTTAAGAGC-3’Leg386R5’-CCAACAGCTAGTTGACATCG-3’引物Ⅱ:Leg226F5’-AGGGTTGATAGGTTAAGAGC-3’Leg226R5’-ATTCCACTACCCTCTCCCATACTCGAGTCAACC-3’巢式PCR酶切分型可直接用于检测临床痰液标本中嗜肺军团菌和非嗜肺军团菌，提高了试验的敏感性和特异性。9、巢式PCR-酶切分型快速检测军团菌10、实时荧光定量PCR快速检测军团菌•引物与探针设计：上游引物：5’-CGGTGAAATGCGTAGAGAT-3’;下游引物:5’-TGCCTCAGTGTCAGTATTRGG-3’；探针：5’-CCGCCTTCGCCACTGGTGTTC-3’（5’-标记FAM，3’-标记TAMRA或BHQ-1）。•反应体系及程序：•临床验证：2009~2010年，采集1063例临床痰液标本，进行荧光PCR检测，同时采用16SrRNAPCR酶切分型和基因测序验证。结果表明荧光定量PCR检测军团菌种具有较好的敏感性和特异性。实时荧光定量PCR法检测军团菌曲线图11、荧光PCR熔解曲线法检测军团菌•引物与探针设计：LegF（5’-AGGGTTGATAGGTTAAGAGC-3’）LegR（5’-CCAACAGCTAGTTGACATCG-3’）锚定探针LegPa（5’-CCCATACTCGAGTCAACC[FAM]-3’）感应探针LegPi（5’-[BHQ1]TATTATCTGACCGTCCCAG[ph]-3’）,5’-端标记BHQ1，3’-端磷酸化。•临床标本检测：对117例呼吸道感染患者痰标本，采用实时荧光PCR熔解曲线分析检测，进一步用基因测序鉴定，比较二种方法，对嗜肺军团菌的检出结果完全一致，说明实时荧光PCR熔解曲线分析是一种有效、可靠的嗜肺军团菌检测方法，其敏感性最低浓度可检出100fg/µL嗜肺军团菌DNA（图15、16）。熔解曲线法检测嗜肺军团菌典型曲线图12、荧光原位杂交检测军团菌•探针设计与标记：军团菌属探针（LEG705）：5’-CGTCCTCAGACATCATCC-3’；检测长滩军团菌（LEGLong）：5’-CTGGTGTCCCTTCCGAT-3’，探针5’用FITC（异硫氰酸荧光素）标记。•杂交程序：•结果观察：在荧光显微镜阳性菌株，可见绿色荧光（如右图）。13、基因测序在军团菌分型鉴定中应用•军团菌16SrRNA和mip基因测序分型；•嗜肺军团菌SBT基因测序分型；•MLSA（多位点序列分析）。军团菌临床标本检验流程军团菌水样检验流程谢谢！