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，张红刚1，费晓庆2，鞠熀先2，刘胜利11东南大学医学院附属中大医院，南京(210009)2南京大学化学化工学院分析化学国家重点实验室，南京（210018）E-mail：lsl88408@163.com摘要：目的：明确干扰胰腺癌细胞膜上hENT1能否增加细胞内5-FU浓度。方法：将能特异性下调hENT1的pSilence-hENT14.1-CMVneo的重组质粒转染到胰腺癌SW1990细胞内，G418筛选阳性克隆细胞。分别培养SW1990细胞、pSilence-hENT1SiSW1990、pSilence-ControlSW1990细胞，并置于含5-FU100µg·ml-1的DMEM中温浴，分别温浴15，30，60，120，240min后，细胞用橡皮刮取收集。各组取等量细胞刮取液2份100µl，一份用毛细管区带电泳测定5-FU含量、另一份用作平行样本测定蛋白含量。根据蛋白—细胞数量标准曲线来确定平行样本中细胞数，再用血细胞分析仪确定细胞体积，最后，计算单细胞内药物总量及浓度。结果：pSilence-hENT1SiSW1990细胞hENT1mRNA表达水平下调50%。SW1990组用含5-FU(100µg·ml-1)的DMEM培养基温育后，细胞内药物浓度在15min时迅速升高(64.95±1.65pg·nl-1)，120min后处于平台期(84.51±2.30pg·nl-1)。相比之下，pSilence-hENT1SiSW1990细胞内5-FU浓度开始上升较慢，15min时为46.25±2.50pg·nl-1，随着温浴时间延长，5-FU在细胞内浓度逐渐升高，120min时为113.29±6.41pg·nl-1，此后细胞内浓度基本处于稳定，高于对照组中浓度(p0.05)。结论：干扰hENT1表达可以提高5-FU在胰腺癌细胞sw1990内浓度。hENT1是胰腺癌sw1990细胞向外返流5-FU的主要通道。关键词：核苷转运载体；RNA干扰；5-氟尿嘧啶；胰腺癌细胞株；毛细管区带电泳核苷类化疗药物是临床治疗胰腺癌最常用的化疗药物，具有亲水性，不易透过细胞膜。这类化疗药物需借助于细胞膜上的核苷载体(nucleosidetransporters，NTs)跨膜转运进入细胞[1]。根据对Na+依赖与否，人类NTs可分为两大类[2]，即平衡型核苷载体(humanequilibrativenucleosidetransporter,hENTs)和浓度依赖型核苷载体(humanconcentrativenucleosidetransporter,hCNTs)。目前发现人类NTs存在9个亚型，hENTs有四个亚型(hENT1~hENT4)[2]。由于hENTs转运动力为细胞膜两侧的药物浓度差，即对核苷类药物具有双向转运作用[3]，hENTs在细胞表面的分布可能与肿瘤细胞耐药有关[4]。我们以前的研究证实，阻断hENTs可提高5-FU在肿瘤细胞内的浓度和毒性[5]。我们进一步研究显示，干扰hENT1表达可明显增加核苷类药物5-氟尿嘧啶(5-FU)对胰腺癌SW1990细胞的毒性[6]。hENT1转运核苷流通量较大[2]，在胰腺癌组织中分布亦较广泛[4]，推测胰腺癌细胞hENT1可能是5-FU向细胞外返流的主要通道。若如此，干扰胰腺癌细胞hENT1表达后可能提高5-FU在细胞内浓度。本文将干扰胰腺癌细胞hENT1表达，进一步研究5-FU在胰腺癌细胞内的浓聚过程。1.材料和方法1.1仪器与试剂所使用的化学试剂均为分析纯。5-FU(批号0597)由美国Sigma公司生产，脂质体Lipofectamine2000(含opti-mem)产自美国Invitrogen公司(批号11668019)，BCA试剂盒由碧云天公司生产(批号20031215)，RIPA试剂盒由上海申能博彩公司生产(批号061102)，小牛血清由杭州四季青公司提供(批号20020114)，G418由美国GIBCO公司提供(批号11811031)。毛细管区带电泳仪(HP3DCE型)为德国Agilent公司产品，毛细管柱由Agilent公1本课题得到东南大学913/事业基金资助项目(9290001327)的资助。司生产，酶标仪(550型)为日本Bio-RAD公司产品。血细胞分析仪为日本Sysmex公司产品(F820)。1.2细胞转染1.2.1质粒重组与细胞转染用我们以前使用的方法构建特异性针对hENT1的可编码shRNA的DNA片断[6]。根据hENT1基因序列(Pubmed，GeneBanknumber:AF079117hENT1，498bp)，用Ambion公司在线siRNA软件设计shRNA的DNA片断(55bp)[7]，该片断由上海申能博彩生物有限公司合成。将shRNA的DNA片断与pSilence4.1-CMVneo载体质粒(4944pb)进行重组，得pSilence-hENT14.1-CMVneo重组质粒，并用大肠杆菌E.coliDH5α扩增、纯化，然后测序。载体质粒试剂盒所提供的pSilence-Control质粒作对照[6]。胰腺癌SW1990细胞由东南大学基础医学院病理实验室提供，细胞用高糖DMEM培养液培养(含10%小牛血清、100IU·ml-1链霉素、100IU·ml-1青霉素，375%CO2)℃。将细胞接种于六孔板(2×105个·孔-1)，分为pSilence-hENT1Si组、pSilence-Control质粒对照组和空白对照组。待细胞生长至密度达70%进行细胞转染。细胞转染用脂质体法。先制备质粒-脂质体混合液，即将重组质粒或对照质粒2µg、脂质体Lipofectamine20004µl、opti-mem200µl混匀，室温孵育15min。细胞用无血清DMEM液洗涤三次后，加入质粒-脂质体混合液，再加无血清、无抗生素的DMEM高糖培养液1.5ml，孵育5h(37℃5%CO2)，然后换普通培养液继续培养，48h后培养液更换为含400µg·ml-1G418的DMEM培养液。经转染的细胞培养约10天后，若仍成活并形成细胞克隆，这些细胞克隆被视为阳性转染细胞，即为pSilence-hENT1SiSW1990细胞或pSilence-ControlSW1990细胞。此后，阳性转染细胞用含维持浓度G418(200µg·ml-1)的DMEM液继续培养并扩增。1.2.2检测各组细胞hENT1mRNA的表达情况分别收集各组细胞(细胞数1×107个)，按Trizol试剂盒说明提取RNA。所提取的总RNA用紫外分光光度计进行定量，并用琼脂糖电泳(1.0％琼脂糖凝胶，电压80V，时间30min)检测完整性。将RNA浓度调整至1µg·µl-1备用。用RT－PCR检测各组hENT1的表达。hENT1探针根据其基因编码(GeneBanknumber:AF079117hENT1，1498bp)设计，其引物上游序列为5’-AGCAGGCAAAGAGGAATCTGGAGT-3’,下游为5’-GAAGGCAAAGGCAGCCATGAAGAA-3’(扩增片断436bp)。内参β-actin引物上游序列为5’-CGTCTGGACCTGGCTGGCCGGGACC-3’,下游为5’-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATG-3’(扩增片断600bp)。以各组总RNA为模板(1µg)，按TaKaRa公司试剂盒提供的方法进行RT-PCR，反应条件预变性94℃、3min，变性94℃、30s，退火55℃、30s，延伸72℃、1min，共35个循环；最后延伸72℃、7min。RT-PCR终产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳分离(电压80V，时间30min)，电泳条带用Smartview2001图像分析处理系统测定［6］。计算hENT1与内参条带光密度比值。上述各实验重复3次。1.3检测细胞内5-FU浓度本研究用ProcházkováA法测定样本5-FU含量［8］，通过测定平行样本中总蛋白含量来确定样本中的细胞数量，根据样本中5-FU含量与平行样本中细胞数量计算单细胞中5-FU含量，然后根据所测定的细胞体积计算出细胞内5-FU浓度。毛细管区带电泳（CEZ）方法检测样本中5-FU的含量。各组细胞在直径15cm的培养皿中培养至细胞数2×107个后，用含5-FU(100µg·ml-1)的DMEN培养液在37oC细胞培养箱温浴，温浴时间序列为15min、30min、60min、120min、240min。温浴结束后细胞用PBS(4oC，pH7.2)冲洗3遍，然后用橡皮擦将细胞刮下，收集细胞混悬液。各组取细胞混悬液100µl两份，一份用于测定5-FU的含量、另一份作为平行样本用于测定蛋白质含量。药物空白细胞作检测时消除背景用。用ProcházkováA法检测样本中5-FU的含量。CZE毛细管长50cm，有效检测长度42.5cm，内径50µm，毛细管柱内硅胶填充。检测5-FU前，毛细管柱依次用1MNaOH灌洗1min、0.1MNaOH1.3min、双蒸水1.0min、30mM硼酸钠(PH9.2)缓冲液1.2min。5-FU检测条件：温度30℃，电压25Kv，检测波长200nm，进样时间6秒［9］。取5-FU标准浓度序列4pg·nl-1、8pg·nl-1、12pg·nl-1、16pg·nl-1、20pg·nl-1，根据5-FU浓度与峰高制定标准曲线。用乙腈裂解细胞混悬液样本中细胞［9］，样本与乙腈以1:2(V·V-1)混合、震荡后离心(9000g，3min)，取上清液进行5-FU检测，记录峰高。根据标准曲线计算出各样本5-FU浓度，再根据检测样本总体积计算出各样本中5-FU含量。1.3.2检测平行样本中蛋白含量根据BCA试剂盒说明，设定标准曲线的蛋白浓度序列为0、5、10、20、40、80µg·ml-1，用BCA法(日本Bio-RAD550型，波长540nm，检测温度20)℃测定吸光度，制定吸光度与蛋白浓度的标准曲线。细胞混悬液平行样本(100µl)与RIPA细胞裂解液以1:6混合，并加入蛋白酶抑制剂pmsf10µl，振荡混匀后冰浴30min，离心30min(14000r·min-1，4)℃。取上清液用BCA法检测样本吸光度，再根据吸光度与蛋白浓度的标准曲线计算平行样本蛋白质浓度与含量。1.3.3检测蛋白含量和细胞数量细胞用0.25%的胰蛋白酶消化后收集细胞悬液，用PBS液将细胞悬液定容至10ml。细胞悬液用血细胞计数器(LeitzWetzlar，德国)进行计数。取细胞悬液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml，用细胞裂解液裂解，上清液用BCA法测定蛋白吸光度［9］。根据标准曲线计算蛋白质含量，再根据细胞数量制定蛋白含量和细胞数量的标准曲线。1.3.4采用血细胞分析仪测定细胞体积。各组细胞在培养瓶中培养至细胞数1×107个后，用0.25%的胰蛋白酶消化后收集细胞悬液，用PBS液将细胞悬液定容至2ml，各组细胞悬液分别用血细胞分析仪测定细胞平均。各组细胞均用上述方法测定单细胞内5-FU含量。上述实验重复3次。2.结果2.1各组细胞hENT1mRNA的表达情况RT-PCR结果显示，与SW1990组和pSilence-Control组相比，pSilence-hENT1Si组细胞hENT1mRNA表达明显下调，下调50%(图1)，而pSilence-Control组细胞与未转染细胞hENT1mRNA表达无差异。此说明本研究所采用的质粒载体介导的RNAi方法能干扰的表达，但干扰作用不完全。为验证pSilence-hENT1Si细胞下调hENT1mRNA表达的稳定性，在转染细胞阳性克隆形成后第30、60、90天