NYT 4189-2022 化学农药 两栖类动物变态发育试验准则

20221111发布－－20230301－－实施化学农药两栖类动物变态发育试验准则17中华人民共和国农业行业标准备案号：XXXX-XXXXＩＣＳ65.020CCSB4189—2022Chemicalpesticide-testguidelineontheamphibianmetamorphosisassayＮＹ／Ｔ中华人民共和国农业农村部发布NY/T４１８９—２０２２前　　言本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.本文件由农业农村部种植业管理司提出并归口.本文件起草单位:农业农村部农药检定所、浙江省农业科学院农产品质量标准研究所.本文件主要起草人:陈丽萍、尹晓辉、袁善奎、孙健、宋雯、曹玲、吴长兴、程涵智、周欣欣、王胜翔、赵秀振.ⅠNY/T４１８９—２０２２化学农药　两栖类动物变态发育试验准则１　范围本文件规定了化学农药对两栖类动物变态发育试验的材料、条件、操作、质量控制、数据处理、试验报告等的基本要求.本文件适用于测试和评价化学农药对两栖类动物变态发育的影响,其他类型的农药可参照使用.本文件不适用于易挥发和难溶解的化学农药.２　规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.NY/T３２７３　难处理农药水生生物毒性试验指南.３　术语和定义下列术语和定义适用于本文件.３􀆰１吻泄距　snouttoventlength,SVL口至肛门的长度.注:单位为毫米(mm).３􀆰２不同步性发育　developmentalasynchronization特定组织与其他组织在发育过程中出现了偏差的现象.３􀆰３Nieuwkoop/Faber的分期标准　thestagingcriteriaofNieuwkoopandFaber１９９４年PieterD􀆰Nieuwkoop和J􀆰Faber将非洲爪蟾生长发育时期(在２３℃的温度下)的不同阶段进行拍照记录,并形成一套标准的发育数据表.该分期标准将非洲爪蟾从胚胎发育至成蛙共历经的５８d,根据显著形态学标志分成６６期发育阶段.４　试验概述采用流水式或半静态法,将处于５１期(蝌蚪腿芽刚刚出现的发育阶段)的非洲爪蟾蝌蚪暴露于系列浓度的被试物溶液中２１d,测定和观察后肢长度(HLL)、吻泄距(SVL)、湿重、日死亡数、发育阶段、甲状腺组织学,评估被试物是否干扰了蝌蚪变态发育进程和甲状腺组织形态.５　试验方法５􀆰１　材料和条件５􀆰１􀆰１　供试生物５􀆰１􀆰１􀆰１　供试生物的选择供试生物为非洲爪蟾(Xenopuslaevis)蝌蚪.选择受精后１７d内,发育至５１期的健康的、表观正常的蝌蚪.５􀆰１􀆰１􀆰２　成体爪蟾的繁殖与管理１NY/T４１８９—２０２２在实验室条件下,成体爪蟾可自然产卵,也可通过注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)促进产卵以获得试验蝌蚪.选择３对~５对成体爪蟾注射hCG(由０􀆰６％~０􀆰９％生理盐水溶解)催产,雌性注射８００IU~１０００IU,雄性注射６００IU~８００IU.将配对爪蟾置于单独的水缸中,避免干扰以促其抱对.容器底部应具有不锈钢或塑料材质的网筛假底,蛙卵应能通过网筛落至缸底.产卵结束并完成受精后,应立即移走成体爪蟾.５􀆰１􀆰１􀆰３　蝌蚪选择收集受精卵并从每窝受精卵中取样评估其质量.选用最佳的２窝~３窝受精卵(总数量至少１５００个用于培养蝌蚪),分别转移至一个大的平盘或碟中孵化,并用吸管移除死亡或不正常受精卵.４d后,将健康的蝌蚪移至合适数量的饲养容器中(２２±１)℃,同一个试验中用到的全部蝌蚪应来源自同一批次受精卵.此外,还需准备额外的蝌蚪以替换首周饲养期间可能死亡的蝌蚪,保持蝌蚪的饲养密度一致.５􀆰１􀆰１􀆰４　蝌蚪培养与饲喂在驯养和Ｇ试验周期内均用合适的饵料(如丰年虾、草履虫及商用饲料等)饲喂蝌蚪.每天应多次少量(至少２次),并记录饲喂频率.投饵量在确保蝌蚪吃饱的同时应尽量减少残饵量,用虹吸法及时清除残饵和粪便.驯养过程若使用静水系统,培养液至少每周完全更换２次,驯养密度每升水不超过４只;若使用流水系统,则每升水不超过１０只(流速为５０mL/min).在移动、清理以及处理蝌蚪的过程中,降低干扰.饲养期间,避免噪声、震动饲养容器、环境条件的急剧变化(如光照、温度、pH、溶解氧、水流速等).受精卵发育到蝌蚪５１期应不超过１７d.发育过程中每日都要进行观察,以便确定试验开始的时间.５􀆰１􀆰２　被试物试验前应收集被试物的基本信息,如CAS号、分子式、结构式、相对分子量、水溶解度、稳定性及蒸气压等,并建立可靠的定量分析方法(包括添加回收率、仪器检测限等)和暴露方式.５􀆰１􀆰３　主要仪器设备５􀆰１􀆰３􀆰１　玻璃或不锈钢水系统装置.５􀆰１􀆰３􀆰２　繁殖缸.５􀆰１􀆰３􀆰３　控温装置.５􀆰１􀆰３􀆰４　双目解剖显微镜.５􀆰１􀆰３􀆰５　数码相机.５􀆰１􀆰３􀆰６　图像数字化软件.５􀆰１􀆰３􀆰７　天平.５􀆰１􀆰３􀆰８　温度计.５􀆰１􀆰３􀆰９　溶解氧仪.５􀆰１􀆰３􀆰１０　pH计.５􀆰１􀆰３􀆰１１　硬度仪.５􀆰１􀆰３􀆰１２　照度计.５􀆰１􀆰３􀆰１３　各种实验室常用玻璃器皿及工具.５􀆰１􀆰３􀆰１４　移液器.５􀆰１􀆰３􀆰１５　分析仪器等.５􀆰１􀆰４　试验用水试验用水应适合非洲爪蟾蝌蚪正常生长和发育,可采用泉水或活性炭过滤的自来水等.试验开始前应检测水质,水中不应含铜、氯、氯胺、氟化物、高氯酸盐和氯酸盐等物质.试验用水的碘离子(I－)浓度应在０􀆰５μg/L~１０μg/L.若试验用水碘离子未达到最低值,需通过加碘至最低浓度０􀆰５μg/L,并记录试验用水中碘或其他盐类的添加情况.５􀆰１􀆰５　试验容器试验容器应采用玻璃、不锈钢或其他化学惰性材质.容量为４L~１０L,水深１０cm~１５cm,流水装２NY/T４１８９—２０２２置的流速应恒定.５􀆰１􀆰６　试验条件使用荧光灯照明,光照度６００lx~２０００lx,光暗周期为１２h光照/１２h黑暗.水温(２２±１)℃,pH６􀆰５~８􀆰５,溶解氧(DO)＞３􀆰５mg/L(＞空气饱和值的４０％).试验条件应符合附录A的要求.６　试验步骤６􀆰１　暴露方法的选择根据被试农药的特性、稳定性或预备试验结果选择半静态法或流水式方法,优先选择流水式.对于难处理农药(难溶或略溶于水、易挥发、易降解、易被吸收、易被吸附、疏水性、离子型或多组分农药等),按照NY/T３２７３选择试验方法执行.采用半静态法时,蝌蚪在试验前及试验过程都应使用同一种水,试验药液的浓度应保持在设计浓度±２０％.采用流水式试验时,应定期检查储备液与稀释用水的流量,以确保试验液的变化范围控制在１０％以内,流量应为２５mL/min.溶液制备过程应优先采用简单方法,如搅拌或超声.不推荐使用溶剂或分散剂(助溶剂),如需使用,其用量应小于０􀆰１mL(g)/L,且各试验容器中的用量应保持一致.６􀆰２　试验浓度从最大溶解度、急性毒性试验的最大耐受浓度(maximumtoleratedconcentration,急性毒性死亡率低于１０％时被试物的最高浓度)和１００mg/L三者中选取最低的浓度作为蝌蚪变态发育试验(AMA)的最高浓度.浓度梯度按３倍~１０倍设置至少３个浓度组及一个空白对照组.最大试验浓度和最小试验浓度之间的差异至少为１个数量级.若使用溶剂,应同时设置溶剂对照组.每个处理组和对照组(包括空白对照和溶剂对照)均应设至少４个重复.６􀆰３　试验周期蝌蚪发育至５１期开始试验,持续染毒２１d结束试验.６􀆰４　承载量２０只/５L.６􀆰５　染毒试验开始时(０d),将满足发育标准的５１期蝌蚪随机分发到每一暴露容器中,每处理至少４个重复,每重复２０只.然后观察是否存在异常(受伤、异常游动行为等),移除表观异常的蝌蚪并及时补充正常的蝌蚪.５１期蝌蚪的选择具体要求见附录B.６􀆰６　水质测定试验期间,至少每周测定１次所有试验容器中的溶解氧、pH和温度.同时,对试验温度进行连续监测(至少监测其中１个试验容器).６􀆰７　浓度分析试验开始前,应建立被试物在试验溶液中的分析方法及其定量限(LOQ)、标准曲线和回收率等,并进行方法验证,以确认被试物在试验溶液中的稳定性.半静态法试验期间,每周至少取样１次(至少４个样品)进行分析.若采用流水系统,更换储备液时需进行浓度分析,若处理组全部浓度中均检测不到被试物时,应测定储备液浓度并记录系统流速以便计算理论浓度.若测定浓度超出设定浓度的８０％~１２０％,流水式试验中采用测定浓度的算术平均值表示有效浓度,半静态试验中以测定浓度的几何平均值来表示有效浓度.６􀆰８　观察与指标测量６􀆰８􀆰１　第７d测量于试验第７d从每一重复中随机抽取５只蝌蚪,用１５０mg/L~２５０mg/L的MSＧ２２２(以碳酸氢钠缓冲调节pH至７􀆰０)进行麻醉,并用水漂洗且吸干,测量每只蝌蚪的HLL和SVL,并称重(精确至毫克级),宜在双目解剖镜下观察发育阶段.处理后的蝌蚪不再放回试验体系.６􀆰８􀆰２　第２１d测量３NY/T４１８９—２０２２试验结束时(第２１d),按上述方法麻醉各重复蝌蚪,用水漂洗且吸干,测量每只蝌蚪的HLL和SVL,并称重(精确至毫克级).将所有蝌蚪的全身或包含下颚的头部组织样本置于Davidson＇s固定液中固定４８h或７２h,选其中５只蝌蚪单独固定,用于组织病理学分析.单独固定的５只蝌蚪依据空白对照组发育期中位数进行选择.a)　若一个重复中合适发育期的蝌蚪大于５只,则从中随机选择.b)　若一个重复中合适发育期的蝌蚪小于５只:１)　暴露组延缓了发育程度,则从发育期略低于对照组中位数的蝌蚪中选择补充;２)　暴露组加速了发育程度,则从发育期略高于对照组中位数的蝌蚪中选择补充.若处理组蝌蚪的所有发育期与对照组的中位数没有交集,则选择与对照组中位数发育期不同,但符合本重复发育期的蝌蚪样本,用于甲状腺组织病理学分析.此外,若发育阶段不明确(如各部位发育不同步),则从每个重复随机选择５只蝌蚪用于组织病理学分析.应在报告中说明不依据对照中位数发育期进行蝌蚪取样的理由.６􀆰８􀆰３　终点指标６􀆰８􀆰３􀆰１　终点指标观察时期于试验第７d和第２１d测量主要终点值,同时１d~２１d每天观察死亡数.按表１要求的时间点,进行AMA试验各指标调查测量,其中,发育阶段、HLL、SVL和湿重是AMA试验的终点指标.表１　AMA试验主要终点观察时间终点指标１d~２１d(每天)第７d第２１d死亡数√发育阶段√√后肢长(HLL)√√吻泄距(SVL)√√湿重√√甲状腺组织√６􀆰８􀆰３􀆰２　蝌蚪发育阶段采用表２中Nieuwkoop/Faber的分期标准方法,确定蝌蚪的发育期,具体蝌蚪发育分期标志图见附录C.根据发育期数据可确定蝌蚪发育加快、不同步、延缓或无影响.比较处理组与对照组蝌蚪的中位数发育期,判断发育过程的加快或延缓.在组织检验没有畸形或异常而出现发育不同步的状况应写入报告,但不需记录个别蝌蚪的形态形成时间差异或组织发育干扰.表２　Nieuwkoop/Faber分期标准方法的显著形态学分期标志显著形态学标志发育阶段(期)５１５２５３５４５５５６５７５８５９６０６１６２６３６４６５６６后肢√√√√√√√前肢√√√√√颅面结构√√√√嗅觉神经形态学√√√尾长√√√√６􀆰８􀆰３􀆰３　体长与湿重应在试验的第７d、第２１d分别测量SVL与湿重.通过与对照组的比较,这２个指标的变化可以评估被试物对蝌蚪生长速度的影响.SVL测量方法见图１.６􀆰８􀆰３􀆰４　后肢长度应在试验的第７d、第２１d分别测量左后肢的长度,见图１,第７d可直接测量HLL.第２１d时应将后肢贴于身体