NYT 4188-2022 化学农药 大型溞繁殖试验准则

20221111发布－－20230301－－实施化学农药大型繁殖试验准则17中华人民共和国农业行业标准备案号：XXXX-XXXXＩＣＳ65.020CCSB4188—2022Chemicalpesticides—GuidelineforDaphniamagnareproductiontestＮＹ／Ｔ中华人民共和国农业农村部发布NY/T４１８８—２０２２前　　言本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.本文件由农业农村部种植业管理司提出并归口.本文件起草单位:农业农村部农药检定所.本文件主要起草人:黄健、陈朗、周欣欣、安雪花、赵榆、常艳茹、吕露、王菲迪、杜丽娜、袁善奎、刘琼.ⅠNY/T４１８８—２０２２化学农药　大型溞繁殖试验准则１　范围本文件规定了化学农药对大型溞繁殖影响试验的材料与条件、主要仪器设备、试验步骤、质量控制、数据分析和试验报告等的基本要求.本文件适用于为化学农药登记而进行的大型溞繁殖影响试验,其他类型的农药可参照使用.２　规范性引用文件本文件没有规范性引用文件.３　术语和定义下列术语和定义适用于本文件.３􀆰１亲溞　parentanimals试验开始时的受试雌溞.３􀆰２冬卵　dormantegg大型溞进行有性生殖所产受精卵.３􀆰３繁殖量　reproductiveoutput试验期间亲溞所产的存活幼溞数.３􀆰４无可观察效应浓度　noobservedeffectconcentration,NOEC在一定暴露期内,与对照组相比,对受试大型溞在统计学意义上(p＜０􀆰０５)未产生显著影响的最高被试物浓度.注:单位为毫克有效成分每升(mga􀆰i􀆰/L)或微克有效成分每升(μga􀆰i􀆰/L).３􀆰５最低可观察效应浓度　lowestobservedeffectconcentration,LOEC在一定暴露期内,与对照组相比,对受试大型溞(繁殖量和死亡率)在统计学意义上(p＜０􀆰０５)产生显著影响的最低被试物浓度.注:单位为毫克有效成分每升(mga􀆰i􀆰/L)或微克有效成分每升(μga􀆰i􀆰/L).３􀆰６x％效应浓度　x％effectiveconcentration,ECx在一定暴露期内,引起大型溞繁殖量下降x％的被试物浓度.注:单位为毫克有效成分每升(mga􀆰i􀆰/L)或微克有效成分每升(μga􀆰i􀆰/L).４　试验概述将被试物按等比配制一系列不同浓度的试验溶液,将出生２４h内的非头胎幼雌溞(亲溞)暴露于试验溶液中开始试验.从亲溞开始繁殖第１批幼溞开始,每天对每只亲溞所产幼溞的存活数和死亡数(包括死胎数)进行计数与记录.试验周期为２１d.试验结束时,对每只存活亲溞繁殖的存活幼溞总数和每只亲溞从头胎开始每天所产的存活幼溞数进行统计分析,确定无可观察效应浓度(NOEC)、最低可观察效应浓度(LOEC)和x％效应浓度(ECx,如可能),评价被试物对大型溞繁殖能力的影响.１NY/T４１８８—２０２２５　材料和条件５􀆰１　受试生物５􀆰１􀆰１　受试生物为大型溞(DaphniamagnaStraus).大型溞保种期间应保持良好的培养条件,使其处于孤雌生殖状态,避免出现雄溞和冬卵,以及死亡率高(＞５％)、头胎延迟、体色异常等现象.５􀆰１􀆰２　试验前,大型溞应在试验条件下驯养至少３周.驯养期间,大型溞的培养条件(如光照、温度、培养液、饲喂量等)应与试验条件相似.５􀆰１􀆰３　试验开始时,应选用同一个健康母系所产、出生２４h内的非头胎幼雌溞作为受试亲溞.５􀆰２　被试物农药原药或制剂.试验前应收集被试物的基本信息,包括但不限于以下数据.a)　结构式;b)　纯度;c)　溶解性;d)　蒸气压;e)　光化学稳定性;f)　试验条件下的稳定性;g)　pKa;h)　正辛醇/水的分配系数(Pow);i)　大型溞急性毒性试验结果等.５􀆰３　试验容器试验容器应采用玻璃、不锈钢或其他化学惰性材质,尽量避免硅酮管、硅胶密封圈等与大型溞培养液及试验溶液接触.５􀆰４　培养液５􀆰４􀆰１　除被试物含有金属离子外,一般情况下宜使用ElendtM４和ElendtM７培养液,配制方法按附录A执行.如使用其他培养液,其组分中不应含有海藻、土壤提取液等组分不明确的添加物.５􀆰４􀆰２　培养液中含有组分不明确的添加物(尤其是含有碳组分)时,应在试验报告中详细说明.５􀆰４􀆰３　添加藻类食物之前应测定培养液/试验液中的总有机碳(TOC)和/或化学需氧量(COD),TOC应＜２mg/L.５􀆰５　饲喂５􀆰５􀆰１　饲料选择试验期间应选用浓缩的藻细胞悬浮液作为亲溞食物,如普通小球藻(Chlorellavulgaris)、近头状尖胞藻(Raphidocelissubcapitata)(原名Pseudokirchneriellasubcapitata,Selenastrumcapricornutum)或近具刺链带藻(Desmodesmussubspicatus)(原名Scenedesumssubspicatus).可先对藻细胞液进行离心处理,去除上清液后再加入大型溞培养液以获得浓缩的藻细胞悬浮液.５􀆰５􀆰２　饲喂量５􀆰５􀆰２􀆰１　大型溞饲喂量宜为每天每溞０􀆰１mg有机碳(C)~０􀆰２mgC.５􀆰５􀆰２􀆰２　藻细胞悬浮液的碳含量可通过替代指标(如藻细胞数或吸光度)进行测量和计算.各实验室应建立碳含量与替代指标之间的线性图,详见附录B.该线性图应至少每年校准一次,且当藻类的培养条件发生变化时,应增加校准频率.５􀆰５􀆰３　饲喂频率５􀆰５􀆰３􀆰１　宜每天饲喂.半静态试验中,应至少每周饲喂３次(如更换试验溶液时).５􀆰５􀆰３􀆰２　尽量使用充分浓缩的藻细胞悬浮液,减少食物添加对暴露浓度的稀释.流水式试验中应详细描述饲喂量.２NY/T４１８８—２０２２５􀆰６　负载率５􀆰６􀆰１　半静态试验中,亲溞应分开培养,即每个容器１只,容器中试验溶液体积为５０mL~１００mL.５􀆰６􀆰２　可根据被试物浓度分析的需要适当增加试验溶液体积,也可将各重复试验溶液合并后进行分析.５􀆰６􀆰３　若试验溶液体积超过１００mL,需加大饲喂量,使其满足饲喂量标准.５􀆰７　光照条件光照/黑暗时间比为１６h∶８h.水面处光强１５μE/m２/s~２０μE/m２/s(或１０００lx~１５００lx).５􀆰８　温度条件试验溶液的温度应控制在１８℃~２２℃.同一个试验中,试验溶液的每日温度变化范围不应超过２℃(如１９℃~２１℃),试验中宜增加１个试验容器专门用于实际水温的持续监测.５􀆰９　其他条件试验开始时和试验期间溶解氧浓度应＞３mg/L.pH应在６~９,且同一个试验中变化范围不应超过１􀆰５个单位.硬度应＞１４０mg/L(以CaCO３计).试验期间不应进行曝气处理.６　主要仪器设备６􀆰１　电子天平(感量０􀆰０００１g以上).６􀆰２　显微镜.６􀆰３　pH计.６􀆰４　溶解氧测定仪.６􀆰５　照度计.６􀆰６　硬度计.６􀆰７　分析仪器.６􀆰８　TOC测定仪或COD测定仪.６􀆰９　环境条件控制和监测的相关设施与设备等.７　试验步骤７􀆰１　试验方法的选择根据被试物的特性选择半静态法或流水式法进行试验.采用半静态法时,试验溶液中被试物的浓度应保持在设定浓度或初始测定浓度的±２０％.对于难处理农药(难溶或略溶于水、易挥发、易降解、易被吸附、疏水性、离子型或多组分农药等),参考NY/T３２７３选择试验方法.７􀆰２　预试验参考被试物及其类似化合物对溞类或其他水生生物的毒性等资料,视需要开展预试验.预试验按正式试验条件,以较大间距设置若干组浓度.试验周期为２１d,当根据阶段性试验结果能够预估出毒性效应水平时,可提前结束预试验.７􀆰３　正式试验正式试验应至少设置５个处理组和１个空白对照组.处理组浓度按几何级数排列,公比≤３􀆰２.对于难溶于水的被试物,可用少量对大型溞无毒的有机溶剂(如丙酮、N,NＧ二甲基甲酰胺等)、乳化剂或分散剂助溶,但助溶剂/助分散剂的用量应尽可能小(≤１００mg/L或≤０􀆰１mL/L),且在各处理组和对照组中的用量一般应尽可能保持一致.此外,还应增设助溶剂/助分散剂对照组.７􀆰３􀆰２　对于半静态试验,每一处理组和对照组应至少１０只溞,单只培养.对于流水式试验,每一处理组和对照组至少２０只溞(以４０只为宜),分配到至少４个重复中.７􀆰３􀆰３　试验开始时,应将亲溞随机分配至各试验容器中.７􀆰３􀆰４　试验周期为２１d.７􀆰４　限度试验３NY/T４１８８—２０２２７􀆰４􀆰１　限度试验浓度为１０mga􀆰i􀆰/L或最大溶解度浓度(二者取较低值).７􀆰４􀆰２　限度试验中,处理组与对照组的各项观测指标应在统计学意义上无显著差异(p＜０􀆰０５).７􀆰５　染毒７􀆰５􀆰１　用培养液将被试物配制成一系列不同浓度的试验溶液,加入试验容器中.７􀆰５􀆰２　向试验容器中加入试验用幼溞.使用宽口径吸管将幼溞加到液面以下.７􀆰５􀆰３　将试验容器置于光照培养箱或人工气候室等设备/设施中,随机摆放.７􀆰６　半静态试验中培养液的更换频率７􀆰６􀆰１　半静态试验中培养液的更换频率取决于被试物的稳定性,但至少每周更换３次(如每周一、周三和周五).若被试物在最长的更换周期内(如３d)不稳定(浓度变化范围超出设定浓度或初始测定浓度的８０％~１２０％),则应增加更换频率,或使用流水式暴露系统.７􀆰６􀆰２　更换试验溶液时,应采用宽口径吸管将亲溞从暴露后的试验溶液(旧液)转移至新配制的试验溶液(新液)中.转移时,随溞转移的旧液体积应尽可能小,尽可能不改变新液体积.７􀆰７　观察与测定７􀆰７􀆰１　亲溞死亡率试验期间应每天记录受试亲溞的死亡或受抑制情况.大型溞死亡或受抑制的判定标准是:不能游动,或轻晃试验容器１５s内未观察到附肢或后腹活动.７􀆰７􀆰２　繁殖量记录受试亲溞的头胎时间及之后几胎的繁殖时间.从头胎开始,应每天从试验容器中移出幼溞,并记录存活幼溞数、死亡幼溞数、死胎数,以及出现雄溞(雄溞的鉴别见附录C)和冬卵的情况等.７􀆰７􀆰３　其他参数７􀆰７􀆰３􀆰１　试验结束时,测定亲溞体长(不含尾刺,精确到０􀆰１mm).７􀆰７􀆰３􀆰２　宜测定的其他参数还包括每只亲溞的产溞次数和产溞总数、每只亲溞每胎产溞数、雄性幼溞数和冬卵数等.７􀆰７􀆰４　水质测定定期测定对照组和最高浓度处理组新液与旧液中的溶解氧浓度、温度、硬度及pH,至少每周测定１次.７􀆰７􀆰５　被试物浓度检测７􀆰７􀆰５􀆰１　半静态试验中,试验浓度可保持在设定浓度的±２０％时,可在试验第１周更换试验溶液前后测定最高和最低浓度处理组新、旧试验溶液中的被试物浓度,之后至少每周测定１次;否则,应测定所有浓度处理组新、旧试验溶液中的被试物浓度.但有充分证据表明初始浓度可重复且稳定时(旧液浓度保持在初始测定浓度的８０％~１２０％),第２周~３周可仅测定最高和最低浓度处理组中的被试物浓度.试验溶液更换前的旧液可仅测定各处理组的其中１个重复.７􀆰７􀆰５􀆰２　流水式试验开始前,应对流水式系统的药液输送和稀释能力进行确认.试验期间,应每天检查试验液与储备液的流速.试验第１周应进行至少３次试验液浓度测定,此后至少每周１次.７􀆰７􀆰５􀆰３　试验期间,若被试物浓度偏差保持在设定浓度或初始测定浓度的±２０％,以设定浓度或初始浓度表示试验结果;若被试物浓度偏差超出设定浓度或初始测定浓度的±２０％,应以时间加权平均浓度表示试验结果(时间加权平均浓度的计算方法见附录D).８　质量控制质量控制条件包括:———试验结束时,对照组亲溞死亡率应≤２０％;———试验结束时,对照组平均每只存活亲溞所产存活幼溞数应≥６０只,且变异系数(CV)≤２５％;———当试验中雄性幼溞数量表现为敏感指标时,