NYT 4195.5-2022 农药登记环境影响试验生物试材培养 第5部分：大型溞

20221111发布－－20230301－－实施农药登记环境影响试验生物试材培养第5部分：大型溞17中华人民共和国农业行业标准备案号：XXXX-XXXXＩＣＳ65.020CCSB4195.5—2022Guidanceonthehousingandcareoforganismsusedforenvironmentalimpacttestofpesticideregistration—Part5:Daphniamagnastaus.ＮＹ／Ｔ中华人民共和国农业农村部发布NY/T４１９５􀆰５—２０２２前　　言本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定起草.NY/T４１９５«农药登记环境影响试验生物试材培养»分为８个部分:———第１部分:蜜蜂;———第２部分:日本鹌鹑;———第３部分:斑马鱼;———第４部分:家蚕;———第５部分:大型溞;———第６部分:近头状尖胞藻;———第７部分:浮萍;———第８部分:赤子爱胜蚓.本文件是NY/T４１９５«农药登记环境影响试验生物试材培养»的第５部分.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.本文件由农业农村部种植业管理司提出并归口.本文件起草单位:农业农村部农药检定所.本文件主要起草人:陈朗、周欣欣、袁善奎、逄森、赵榆、安雪花、王娇、陈丽萍、武祥杰、蒋金花、刘伟、蓝帅、王菲迪.ⅠNY/T４１９５􀆰５—２０２２农药登记环境影响试验生物试材培养第５部分:大型溞１　范围本文件规定了农药登记环境影响试验供试大型溞的引入、验收、纯化、保种、驯养、常规培养和常见异常症状处理等技术方法,以及记录资料要求.本文件适用于大型溞(DaphniamagnaStraus􀆰)的实验室培养,其他品种的溞类可参照使用,如蚤状溞(Daphniapulex).２　规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.GB/T５７４９　生活饮用水卫生标准GB/T３１２７０􀆰１３—２０１４　化学农药环境安全性评价试验准则　第１３部分:溞类急性活动抑制试验NY/T４１８８　化学农药　大型溞繁殖试验准则３　术语和定义下列术语和定义适用于本文件.３􀆰１休眠卵　dormantegg冬卵滞育卵大型溞进行有性生殖所产受精卵.３􀆰２纯化　purification通过纯种分离,使所有生物个体均来自一个亲本的培养过程.本文件指纯化后,所获得的大型溞均来源于同一只雌性溞.４　引入与验收４􀆰１　引入应从专业的大型溞研究或培养机构引入溞种,并由其提供品系证明.４􀆰２　验收新引入的大型溞到达实验室后,在开展相关试验前应进行品系确认.大型溞的生物学背景信息和形态特征见附录A.溞种应来自同一个纯化培养群,即为同一只母溞所产的同一批次溞,否则,引入后应在实验室内进行纯化培养.５　纯化、保种与驯养５􀆰１　纯化挑选出体大、健康(未表现出任何受胁迫现象,例如体色异常)的幼溞若干只,分别加入盛有培养液的１NY/T４１９５􀆰５—２０２２容器中进行单个培养.选择繁殖量大的母溞,收集其所产的第３胎、第４胎或第５胎幼溞,建立纯化群.５􀆰２　保种５􀆰２􀆰１　从纯化培养的大型溞中选出一部分进行连续的群体培养,以种群延续为目的,不用于试验.５􀆰２􀆰２　保种培养期间,每３d~４d清理１次幼溞.每２周~３周更新１次保种批次.５􀆰２􀆰３　保种培养期间,环境条件见６􀆰７部分.可适当降低水温及光照条件要求,但水温不宜超过２５℃.５􀆰２􀆰４　保种培养的大型溞用于试验前,须先将挑选出的幼溞按照本文件第６部分的规定进行常规培养.５􀆰３　驯养常规培养的大型溞用于试验前,应按以下要求进行驯养:———供试幼溞应为实验室内培养３代以上的非头胎幼溞(＜２４h);———供试幼溞应来源于同一个健康的母溞种群(未表现出任何受胁迫现象,异常情况见第７部分),且母溞应在与试验条件(光照、温度、pH、培养液)一致的环境下驯养.用于急性毒性试验时,驯养时间应≥４８h;用于繁殖试验时,驯养时间应≥３周.当常规培养过程中使用的培养液与试验用培养液种类不一致时,应在驯养期间逐步更新培养液.前２周新旧培养液比例由３∶７逐步提高到６∶４,再转换为１００％新培养液培养１周~２周.６　常规培养６􀆰１　培养设备６􀆰１􀆰１　主要仪器设备包括:———显微镜;———电子天平等称量仪器;———培养箱、温度计、pH计、溶解氧测定仪、照度计、硬度计和电导率仪等环境监控仪器设备;———洁净工作台、高压灭菌锅、TOC测定仪和离心机等饵料培养与制备相关设备.６􀆰１􀆰２　培养容器不同来源、不同培养批次的溞应安置在不同编号的容器中单独培养.培养容器应采用玻璃或其他化学惰性材料制成,无毒、无害、无放射性、耐腐蚀、耐冲击.容器内壁应光滑,且便于观察.尽量避免硅酮管、硅胶密封圈等材料与培养液接触.容器上方可覆盖保鲜膜(扎孔)或具孔有机玻璃盖等,减少水分蒸发,避免污染.６􀆰２　培养液６􀆰２􀆰１　宜使用配方明确的重组水,例如ISO标准稀释水、ElendtM４和ElendtM７培养液,配制方法见GB/T３１２７０􀆰１３附录B.配制重组水的试剂应至少为分析纯等级,配制用水应为蒸馏水或去离子水(电导率≤１０μS/cm).６􀆰２􀆰２　除配方明确的重组水外,也可使用自来水等其他水源.自来水应满足GB/T５７４９的要求,其他类型的培养水源应至少每６个月检测１次水质,满足NY/T４１８８«化学农药　大型溞繁殖试验准则»等相关试验准则的要求.６􀆰２􀆰３　每周检测水质.培养液pH应为６~９(以７􀆰８±０􀆰４为宜),硬度为１４０mg/L~２５０mg/L(以CaCO３计).此外,如使用自来水,还应加测残留氯含量(要求＜１０μg/L);如使用其他类型的培养水源,应加测电导率(≤５００μS/cm)、总有机碳(TOC,＜２mg/L)等水质指标.６􀆰２􀆰４　培养液在使用前应曝气处理２４h以上,使溶解氧含量≥３mg/L.６􀆰３　饵料与饲喂６􀆰３􀆰１　使用单种藻或混合藻液作为饵料.藻种宜为近头状尖胞藻(Raphidocelissubcapitata)、普通小球藻(Chlorellavulgaris)等绿藻.６􀆰３􀆰２　饲喂前宜对藻液进行浓缩处理.将培养好的新鲜藻液进行离心(以５０００r/min,１０min为宜)处理,用蒸馏水、去离子水或培养液重新悬浮后继续离心.反复离心３次~４次,用少量培养液重新悬浮后,２NY/T４１９５􀆰５—２０２２冷藏,备用.６􀆰３􀆰３　推荐每日饲喂１次.饲喂量以投喂后培养液呈淡果绿色(或每只溞０􀆰１mg次/d~０􀆰２mg次/d)为宜.６􀆰３􀆰４　每次饲喂时,观察大型溞的生长、繁殖状态,及时清除死亡或不健康的个体以及残渣等.纯化培养和驯养过程中,喂食前应先移除新生幼溞.６􀆰４　更换培养液视需要更换培养液,一般至少每周更换１次.对于保种培养的大型溞,宜每周更换１０％~２０％培养液.６􀆰５　更换培养批次常规培养过程中,应定期更新培养批次.宜收集单个培养容器中的第３胎、第４胎或第５胎幼溞代替其母溞,作为新的培养批次.６􀆰６　母溞或幼溞转移６􀆰６􀆰１　更换培养批次、更换培养液或收集试验用溞过程中,需对母溞或幼溞进行转移.６􀆰６􀆰２　转移母溞时,可采用塑料吸管,并剪去吸管尖端,以保证母溞自由通过.６􀆰６􀆰３　转移幼溞时,对于需丢弃不用的幼溞,可采用筛网分离法.准备两个不同孔径的尼龙筛,上层筛子孔径约为１mm;下层筛子孔径＜０􀆰５mm.将留在上层筛网中的母溞及时放入培养液中.对于试验用幼溞,宜用塑料吸管进行转移,并确保吸管顶端的孔径可使幼溞自由通过,以避免产生机械损伤.６􀆰７　培养条件６􀆰７􀆰１　保持良好的培养条件,使大型溞的繁殖保持孤雌生殖状态.６􀆰７􀆰２　环境条件培养期间,水温应维持在１８℃~２２℃;光照周期为１６h光照:８h黑暗,光照强度为１０００lx~１５００lx,或者在室内自然光照条件下培养.６􀆰７􀆰３　培养密度常规培养及驯养密度以每容器(如１L~２L烧杯)中１０只~３０只溞为宜.纯化培养过程为单只单容器培养.保种培养可采用鱼缸等较大型容器,密度不宜超过６０只/L.７　常见异常症状与处理措施７􀆰１　常见异常症状常见异常症状主要包括:———出现两性生殖,培养系统中可见休眠卵和/或雄性溞,其形态特征见附录A;———１０日龄后仍未产溞或每次产溞数量极少;———生长缓慢、蜕皮不干净;———游动缓慢、浮于液面;———体色异常;———出现大量死胎或死亡幼溞,单日死亡率超过２０％或每天均出现大批量死亡等.７􀆰２　处理措施当大型溞培养过程中出现异常状况,且采取纯化、复壮相关措施后仍未恢复正常时,应重新引种.复壮过程中可采取以下措施改善培养条件:———改善环境条件,如严格控制水温、养殖密度、水质条件,提高培养液更换频率等;———改善喂食条件,如适当提高喂食量,选择便于进食的、细胞个体较小的藻类作为饵料,添加适量酵母或来源明确且无污染的植物汁液等作为营养补充.８　记录资料对每批次保种培养、纯化和常规培养的大型溞,实验室均应保存完整的培养记录,相关原始记录表格３NY/T４１９５􀆰５—２０２２设计见附录B.主要记录资料包括:———引入与验收记录;———保种培养记录;———纯化记录;———常规培养/驯养与领用记录;———培养液配制记录;———饵料(藻液)培养与制备记录;———水质检测记录;———环境条件与水质监测记录等.４NY/T４１９５􀆰５—２０２２附　录　A(资料性)大型溞的生物学背景与形态特征　A􀆰１　生物学背景大型溞属甲壳亚门鳃足纲枝角亚目溞科,广泛分布于世界各地,是农药登记环境影响试验中推荐的模式生物.大型溞为滤食性水生无脊椎生物,属蜕皮生长即不连续生长模式.幼溞经蜕皮３次~４次至性成熟.理想的实验室条件下,大型溞为孤雌生殖方式.２０℃条件下,约６d~８d达到性成熟,８d~１０d开始产第１胎,１０d~１４d产第２胎,之后约每隔２d产１胎.第４胎后产卵间隔逐渐延长,产卵数量逐渐下降.A􀆰２　形态特征A􀆰２􀆰１　雌性溞A􀆰２􀆰１􀆰１　雌性溞体长２􀆰２mm~６􀆰０mm,呈宽卵形,后半部比前半部略狭(见图A􀆰１A和图A􀆰１B).身体为黄色或淡红色,稍透明.壳刺较短,有时几乎完全消失.壳面有菱形花纹.头部宽而低,头顶圆钝,无盔.A􀆰２􀆰１􀆰２　吻部稍突出(见图A􀆰１C).壳弧发达,在壳弧的背前方,各侧都有两条短的纵行褶纹.盲囊一对,长而弯.复眼不大,位于头顶.单眼小,位于第一触角的正上方.A􀆰２􀆰１􀆰３　第一触角短而粗(见图A􀆰１C);角丘尚膨大.第二触角向后伸展时,游泳刚毛的末端不能达到壳瓣的后缘.触角基肢以及内、外肢都被有细毛.A􀆰２􀆰１􀆰４　后腹部较大,向后逐渐收削,在肛门之后的背侧显著凹陷(见图A􀆰１D).肛刺明显地分为前后两列.肛刺的数目变异很大,凹陷前９个~１２个不等,偶尔５个~６个,凹陷后６个~１０个.腹突４个,第一个腹突比第二个长一倍,第二个又比第三个长一倍,第四个最短.后三个腹突的背侧沿缘部分均带细刚毛.A􀆰２􀆰１􀆰５　尾爪略弯曲,有微弱的栉刺２列,前列有小刺８个~１２个,后列１６个~１８个,略长(见图A􀆰１E).栉刺列后还有梳毛列.A􀆰２􀆰２　休眠卵休眠卵(冬卵、滞育卵)有卵鞍保护.卵鞍长而大,内储黑色卵圆形休眠卵２个.休眠卵前后斜卧,其长轴与卵鞍的长轴呈一定角度(见图A􀆰１F).A􀆰２􀆰３　雄性溞A􀆰２􀆰３􀆰１　雄性溞体长约１􀆰７５mm~２􀆰５０mm,壳瓣狭长,背缘平直,前缘与腹缘密生较长的刚毛.前腹较圆而突出.壳刺很短.头部向下弯曲,复眼特别大.吻十分钝.A􀆰２􀆰３􀆰２　第一触角很长,两端略短(见图A􀆰