NYT 4195.3-2022 农药登记环境影响试验生物试材培养 第3部分：斑马鱼

20221111发布－－20230301－－实施农药登记环境影响试验生物试材培养第3部分：斑马鱼17中华人民共和国农业行业标准备案号：XXXX-XXXXＩＣＳ65.020CCSB4195.3—2022Guidanceonthehousingandcareoforganismsusedforenvironmentalimpacttestofpesticideregistration—Part3:BrachydaniorerioＮＹ／Ｔ中华人民共和国农业农村部发布NY/T４１９５􀆰３—２０２２前　　言本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定起草.NY/T４１９５«农药登记环境影响试验生物试材培养»分为８个部分:———第１部分:蜜蜂;———第２部分:日本鹌鹑;———第３部分:斑马鱼;———第４部分:家蚕;———第５部分:大型溞;———第６部分:近头状尖胞藻;———第７部分:浮萍;———第８部分:赤子爱胜蚓.本文件是NY/T４１９５«农药登记环境影响试验生物试材培养»的第３部分.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.本文件由农业农村部种植业管理司提出并归口.本文件起草单位:农业农村部农药检定所.本文件主要起草人:陈朗、王寿山、袁善奎、吴声敢、查金苗、周艳明、周欣欣、洪响声、蒋金花、赵学平、闫赛红.ⅠNY/T４１９５􀆰３—２０２２农药登记环境影响试验生物试材培养第３部分:斑马鱼１　范围本文件规定了农药登记环境影响试验用斑马鱼(Brachydaniorerio)的引入、验收、驯养、饲养和繁育等技术方法,以及记录资料要求.本文件适用于斑马鱼的实验室培养,其他品种的鱼类可参照使用.２　规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.GB/T５７４９　生活饮用水卫生标准GB/T１４９２４􀆰１　实验动物配合饲料通用质量标准GB/T３１２７０􀆰１２　化学农药环境安全评价试验准则　第１２部分:鱼类急性毒性试验NY/T３１５２􀆰４　微生物农药环境风险评价试验准则　第４部分:鱼类NY/T４１８６　化学农药　鱼类早期生活阶段试验准则３　术语和定义下列术语和定义适用于本文件.３􀆰１试验用鱼　testfish经人工繁育,遗传背景明确或来源清楚,用于农药环境影响试验的鱼类,本文件中仅指斑马鱼(Brachydaniorerio).３􀆰２亲鱼　broodfish供繁殖用的雌成鱼和雄成鱼.３􀆰３胚胎期　embryostage从卵受精开始至胚胎破膜孵出的整个发育阶段.３􀆰４仔鱼期　larvastage从胚胎破膜孵出到卵黄囊吸收完毕的发育阶段.３􀆰５稚鱼期　juvenilestage从卵黄囊吸收完毕到体形迅速趋近成鱼的发育阶段.３􀆰６幼鱼期　subＧadultstage体形与成鱼完全相同但未性成熟的发育阶段,通常为１月龄~３月龄.３􀆰７成鱼期　adultfish１NY/T４１９５􀆰３—２０２２出现第二性征,达到性成熟的阶段,一般为３月龄以上.３􀆰８生物饲料　livingfeed适宜于室内人工培养,且适合斑马鱼采食的饲料生物.３􀆰９配合饲料　formulafeed根据试验用鱼的营养需求,将多种饲料原料按饲料配方经工业化生产获得的均匀混合物.４　引入与验收４􀆰１　引入４􀆰１􀆰１　试验用斑马鱼应至少提前９d引入至实验室,使其适应实验室的环境条件.４􀆰１􀆰２　选择能够出具品系证明的供应商.斑马鱼的形态特征见附录A.每批次斑马鱼均应具有明确的来源、鱼龄、数量等信息.４􀆰１􀆰３　斑马鱼到达实验室之前,应将鱼缸、渔具清洗干净,必要时采用次氯酸钠、高锰酸钾溶液等进行浸泡消毒处理.４􀆰２　验收随机选取该批次斑马鱼的１􀆰０％~１􀆰５％(引入数量≤１０００尾时,至少１０尾),分别进行全长和体重的测定,判断是否满足试验需求.４􀆰３　暂养观察４􀆰３􀆰１　验收合格后,应将斑马鱼安置在暂养区.暂养区与饲养区应保持隔离,暂养条件与饲养条件相同.４􀆰３􀆰２　对进出暂养区的人员、物品采取隔离措施.人员应穿戴工作服和手套,物品应进行消毒处理.４􀆰３􀆰３　暂养期间,观察整批鱼的健康状态,例如有无畸形、行动异常及死亡出现.斑马鱼的常见疾病见附录B.２d后,如斑马鱼健康状态正常,可转移至饲养室进行常规饲养或驯养.否则,应延长暂养期或弃用该批鱼.５　驯养５􀆰１　驯养期用于试验之前,斑马鱼应至少驯养并观察７d.５􀆰２　驯养条件驯养期内,饲养用水与饲养条件应与试验时相同.不同类别试验的试验条件见GB/T３１２７０􀆰１２、NY/T３１５２􀆰４、NY/T４１８６.５􀆰３　驯养期合格标准驯养期内,判断斑马鱼可用于试验的标准为:———当７d累计死亡率≤５％时,可用于试验;———当７d累计死亡率在５％~１０％,则继续驯养７d,若死亡率仍超过５％,弃用该批鱼;———当７d累计死亡率超过１０％时,弃用该批鱼.６　饲养管理６􀆰１　养殖系统６􀆰１􀆰１　配备足够的斑马鱼养殖设施、设备及养殖容器,将不同来源、不同批次的斑马鱼安置在不同的养殖单元中饲养.６􀆰１􀆰２　养殖容器应采用化学惰性材料制成,无毒、无害、无放射性、耐腐蚀、耐冲击.容器内壁应光滑,侧壁或顶部应至少局部透明,便于观察.２NY/T４１９５􀆰３—２０２２６􀆰１􀆰３　配备水处理相关设备、配件,并定期清洗与维护,包括:———供排水设备,无毒、无污染、内表面清洁、便于清洁;———消毒杀菌设备,如紫外或臭氧杀菌装置;———增氧设备(如需),以满足养殖水中的溶解氧含量等要求;———使用循环式流水养殖系统时,还需配备筛网过滤设备、蛋白分离与微滤设备,以及生物处理设备,如由碎石、细沙、塑料粒、磁环或活性炭等滤料构成的生物过滤器,并定期进行活化处理;———每个独立的养殖单元/容器宜配备１套专用渔具.６􀆰２　养殖用水６􀆰２􀆰１　养殖用水宜为配方明确的稀释水或经过曝气处理的自来水.配制稀释水的试剂应至少为分析纯等级,配制用水应为蒸馏水或去离子水(电导率≤１０μS/cm).６􀆰２􀆰２　水质应满足GB/T５７４９及相关试验准则的要求.除配方明确的标准稀释水、饮用水外,其他类型的养殖水源应至少每６个月检测１次水质.养殖用水的水温、溶解氧含量、总氨氮、pH、总硬度和盐度要求及其检测频率见附录C.６􀆰３　环境条件不同生长发育阶段的斑马鱼所需的环境条件见附录C.斑马鱼成鱼饲养密度宜≤５尾/L,幼鱼宜≤１５尾/L.６􀆰４　饲喂６􀆰４􀆰１　饲料６􀆰４􀆰１􀆰１　饲喂配合饲料或生物饲料,也可二者搭配使用.根据斑马鱼的生长发育阶段适时调整饲料的种类或规格,见附录C.６􀆰４􀆰１􀆰２　配合饲料应符合GB/T１４９２４􀆰１的要求,且不含抗生素、驱虫剂、防腐剂、色素、促生长剂以及激素等可能对斑马鱼产生干扰的物质.６􀆰４􀆰１􀆰３　饲料应在低温、干燥、避光环境下妥善储存,避免污染.６􀆰４􀆰２　饲喂宜每日饲喂.饲喂量应保证鱼可吃饱,但每日投喂总量宜≤鱼体重的３％.饲喂后,及时除去鱼粪便和食物残渣.饲喂方法见附录C.６􀆰５　疾病防治６􀆰５􀆰１　饲养过程中,每天观察并记录斑马鱼的健康状况.斑马鱼常见疾病见附录B.６􀆰５􀆰２　任何鱼表现出疾病症状时,应将病鱼取出并实施安乐死,并根据需要对该养殖容器/单元内剩余的鱼进行隔离处理(至少１４d),疾病防治方法见附录B.６􀆰５􀆰３　如果在隔离防治期间没有更多的鱼表现出疾病症状,可转为正常饲养.如果临床症状再次出现,应考虑延长隔离期或放弃该养殖容器/单元中的鱼.６􀆰５􀆰４　当斑马鱼出现大批量染病(染病率超过４０％或死亡率超过１０％)时,应将整个养殖容器/单元中的鱼进行安乐死处理,并对该容器/单元以及使用过的滤布、渔网、虹吸管等器具进行消毒和清洗.６􀆰５􀆰５　对于进行过疾病防治的鱼,停止用药至少１４d后方能用于急性毒性试验,至少２个月后方能用于繁殖.６􀆰６　安乐死６􀆰６􀆰１　实施对象对病鱼或其他被淘汰的斑马鱼及时进行安乐死处理.６􀆰６􀆰２　实施方法６􀆰６􀆰２􀆰１　高剂量麻醉法将斑马鱼成鱼浸入２５０mg/L~５００mg/L间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐溶液中１０min以上.间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐溶液需用NaHCO３调节pH至７􀆰０~７􀆰５,避光冷藏保存,保质期１个月.３NY/T４１９５􀆰３—２０２２６􀆰６􀆰２􀆰２　冰浴法将斑马鱼移入２℃~４℃冰水中,成鱼浸泡１０min以上,幼鱼浸泡２０min以上.６􀆰６􀆰３　安乐死后的斑马鱼以及试验中死亡的斑马鱼,均按照生物医学实验垃圾处理.７　繁育管理７􀆰１　亲鱼选择７􀆰１􀆰１　斑马鱼亲鱼应来源明确,且遗传背景清晰.宜选用６月龄~１８月龄、处于生产高峰期的成鱼作为亲鱼.７􀆰１􀆰２　如使用实验室内繁育的斑马鱼作为亲鱼,必要时对亲鱼进行遗传质量检测.７􀆰２　亲鱼交配７􀆰２􀆰１　繁殖前,将斑马鱼雌鱼和雄鱼分开饲养,并确保食物充足.７􀆰２􀆰２　于计划产卵的前一天下午或傍晚,选择健康的斑马鱼亲鱼,以雌雄比１:１或１:２放入交配盒.用隔板将雌鱼和雄鱼分开,并关闭光照.交配盒内加水约２/３缸,密度宜为１􀆰５L水/对亲鱼.７􀆰２􀆰３　第２天早晨,抽开隔板,用微弱的光线促进产卵.７􀆰２􀆰４　斑马鱼雌鱼宜定期交配,将体内的卵排出,但２次交配之间需间隔１周左右.７􀆰３　胚胎培育７􀆰３􀆰１　产卵后,移走斑马鱼亲鱼,清除未受精卵、死卵及亲鱼粪便等污物.然后,将受精卵转入到新容器中.培育条件见附录C.其间,及时移除发白或呈蓝色的受精卵.７􀆰３􀆰２　对于非直接用于试验的斑马鱼胚胎,在孵化前可使用亚甲基蓝溶液、碘消毒剂和次氯酸消毒剂等对胚胎进行浸泡消毒处理.７􀆰４　仔鱼培育斑马鱼仔鱼的培育条件和饲喂方法见附录C,孵化后２d左右可开始饲喂开口饲料.其间,及时清除死亡的仔鱼及食物残渣等.７􀆰５　稚鱼和幼鱼培育斑马鱼稚鱼、幼鱼的培育条件和饲喂方法见附录C.其间,及时清除死鱼、食物残渣和粪便等.８　记录资料８􀆰１　养殖设施设备、水处理设备、水质监控与培养箱等设备应配备标准操作规程,规范操作,并保存购入、验收、维修、使用和维护等相关记录.８􀆰２　对于每批次斑马鱼,实验室应保存完整的饲养和繁殖记录,相关原始记录见附录D.主要记录资料包括:———引入与验收记录;———驯养与暂养记录;———健康检查与疾病治疗记录;———饲养记录;———繁殖记录;———受精卵消毒、孵化与培养记录;———饲料购置或培养记录;———器具清洗消毒记录;———斑马鱼领用与处理记录;———水质、饲料检测报告;———环境条件与水质监测记录等.４NY/T４１９５􀆰３—２０２２附　录　A(资料性)斑马鱼形态特征　斑马鱼原产于印度和孟加拉国,属鳍鱼纲鲤形目鲤科,常被作为农药环境影响试验的代表性试验用鱼,实验室内饲养条件下寿命约２年.斑马鱼成鱼的形态特征见图A􀆰１.斑马鱼成鱼呈纺锤形,头小而稍尖,吻较短,尾鳍较长,呈叉形;体侧及臀鳍部布满银蓝色纵纹似斑马.雄鱼体形修长,银蓝色纵纹与柠檬色纵纹相间排列.雌鱼体型丰满,银蓝色纵纹与银灰色纵纹相间,携卵时腹部膨大.图A􀆰１　斑马鱼雌鱼和雄鱼形态特征５NY/T４１９５􀆰３—２０２２附　录　B(资料性)斑马鱼常见疾病　斑马鱼主要疾病、主要病原/病因、主要症状和防治方法见表B􀆰１.发现疾病后如采取相关防治处理措施,应详细记录,并在试验报告中描述防治时间与方法.表B􀆰１　主要疾病、主要病原/病因、主要症状和防治方法主要疾病主要病原/病因主要症状防治方法分枝杆菌病　分枝杆菌属(Mycobacteriumsp􀆰)　溃疡、出血、头部周围充血、鱼鳞凸起、鱼鳍磨损、皮肤或者鳃苍白　内脏器官有白色结节出现,对内脏