NYT 4195.6-2022 农药登记环境影响试验生物试材培养 第6部分：近头状尖胞藻

20221111发布－－20230301－－实施农药登记环境影响试验生物试材培养第6部分：近头状尖胞藻04中华人民共和国农业行业标准备案号：XXXX-XXXXＩＣＳ65.020CCSB4195.6—2022Guidanceonthehousingandcareoforganismsusedforenvironmentalimpacttestofpesticideregistration—Part6:RaphidocelissubcapitataＮＹ／Ｔ中华人民共和国农业农村部发布NY/T４１９５􀆰６—２０２２前　　言本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定起草.NY/T４１９５«农药登记环境影响试验生物试材培养»分为８个部分:———第１部分:蜜蜂;———第２部分:日本鹌鹑;———第３部分:斑马鱼;———第４部分:家蚕;———第５部分:大型溞;———第６部分:近头状尖胞藻;———第７部分:浮萍;———第８部分:赤子爱胜蚓.本文件是NY/T４１９５«农药登记环境影响试验生物试材培养»的第６部分.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.本文件由农业农村部种植业管理司提出并归口.本文件起草单位:农业农村部农药检定所.本文件主要起草人:陈朗、周欣欣、袁善奎、蒲倩云、安雪花、张璋、毛连纲、俞瑞鲜、崔晓、赵秀振.ⅠNY/T４１９５􀆰６—２０２２农药登记环境影响试验生物试材培养第６部分:近头状尖胞藻１　范围本文件规定了农药登记环境影响试验用近头状尖胞藻的引入、验收、培养条件、保种培养、预培养等技术方法,以及记录资料要求.本文件适用于近头状尖胞藻(Raphidocelissubcapitata)的实验室培养,其他品种的淡水绿藻,如普通小球藻(Chlorellavulgaris)、近具刺链带藻(Desmodesmussubspicatus,曾用名:ScenedesmussubspicaＧtus)等可参照使用.２　规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.GB/T３１２７０􀆰１４　化学农药环境安全评价试验准则　第１４部分:藻类生长抑制试验３　术语和定义下列术语和定义适用于本文件.３􀆰１保种培养　stockculture在实验室内用固体或液体培养基小规模培养单一藻种,以备分离、转移到新鲜培养基中并培养成为受试藻的过程.３􀆰２预培养　preＧculture试验前,将藻细胞接种至与试验时相同的无菌培养基中,在试验要求的相同条件下培养,使其达到对数生长状态的过程.４　引入与验收４􀆰１　应从专业的藻类研究或培养机构引入藻种,并由其提供品系证明.藻种到达实验室后进行品系确认,近头状尖胞藻的生物学背景和形态学特征见附录A.４􀆰２　提前准备好培养基,藻种到达后尽快进行转接.４􀆰３　首次引入该藻类品种时,接收后应在实验室内至少培养６周,建立起反复接种培养的能力后,再开展试验.５　材料与设备５􀆰１　培养设备５􀆰１􀆰１　主要仪器设备包括:———洁净工作台、高压灭菌锅等无菌操作相关设备;———恒温振荡光照培养箱、光照培养箱、冰箱等培养或保种培养设备;———生物显微镜、血球计数板或流式细胞仪、紫外分光光度计等观察与计数仪器;———温度计、照度计(球形传感器/余弦传感器)、pH计等环境监控仪器设备;１NY/T４１９５􀆰６—２０２２———电子天平等称量仪器.５􀆰１􀆰２　培养容器应采用玻璃或其他化学惰性材料制成,且透光性好.常采用玻璃锥形瓶、螺口玻璃试管等.同时,配备透气棉塞或透气封口膜等,便于容器内外部的空气交换.所有器皿、封口材料、吸管等在使用前均应进行高压灭菌(１２１℃,≥１５min).５􀆰２　培养基５􀆰２􀆰１　培养基的选择根据藻种选择适宜其生长的培养基.近头状尖胞藻可在多种培养基中保存,宜使用BG１１培养基、OECD藻类培养基或AAP藻类培养基.５􀆰２􀆰２　培养基配制方法５􀆰２􀆰２􀆰１　液体培养基BG１１培养基的配制方法见GB/T３１２７０􀆰１４,OECD藻类培养基或AAP藻类培养基的配制方法见附录B.５􀆰２􀆰２􀆰２　固体培养基每升液体培养基中加入约８克琼脂条或琼脂粉,经高压灭菌(１２１℃,１５min~２０min)后,在试管中铺成斜面培养基,冷却备用.５􀆰２􀆰２􀆰３　配制培养基的试剂应为分析纯以上等级.配制用水应为电导率≤１０μS/cm的蒸馏水或去离子水.６　培养方法６􀆰１　保种培养６􀆰１􀆰１　液体培养基培养６􀆰１􀆰１􀆰１　液体培养基在室温下平衡后,将一定量的藻细胞转接至培养基中,摇匀.６􀆰１􀆰１􀆰２　在１８℃~２４℃条件下培养,采用持续、均匀的荧光照明,液面光合有效辐射(４００nm~７００nm)保持在６０μE/(m２􀅰s)~１２０μE/(m２􀅰s)(相当于冷白光源条件下光强４４４０lx~８８８０lx).培养期间,保持持续振荡或搅拌.６􀆰１􀆰１􀆰３　根据培养条件和生长状况,每３d~１５d转接１次(如装有１００mL藻液的锥形瓶,置于２０℃持续光照下培养,可每周转接１次).６􀆰１􀆰１􀆰４　进行长期保种时,将处于对数生长期的藻培养液在０℃~８℃条件下冷藏、避光保存,每半年转接１次.６􀆰１􀆰２　固体培养基培养６􀆰１􀆰２􀆰１　进行长期保种时,也可将处于对数生长期的藻培养液划线转接到固体斜面培养基上,封口.在２１℃~２４℃、４４４０lx~８８８０lx持续光照条件下培养至固体培养基表面长出藻细胞,然后,转为在０℃~８℃条件下冷藏、避光保存.６􀆰１􀆰２􀆰２　每２个月进行１次复壮.将藻体转接到液体培养基中培养至对数生长状态,转接１次~２次后再转为固体培养基培养.６􀆰１􀆰２􀆰３　所有操作必须在无菌条件下进行,以免受到细菌、真菌或其他藻类的污染.６􀆰１􀆰３　状态检查６􀆰１􀆰３􀆰１　定期镜检,以确认藻液是否被污染.６􀆰１􀆰３􀆰２　当出现轻微污染时,可采取以下分离措施:———脱脂棉或滤纸过滤,适用于寄生虫和藻细胞体积相差较大的情况;———离心法分离,适用于寄生虫和藻细胞重量相差较大的情况;———琼脂板划线培养进行分离纯化等.２NY/T４１９５􀆰６—２０２２６􀆰１􀆰３􀆰３　当污染严重时,应重新引入新的藻种.６􀆰２　预培养６􀆰２􀆰１　在２１℃~２４℃、４４４０lx~８８８０lx持续光照条件下培养,不同位点光照强度差异应控制在１５％范围内.６􀆰２􀆰２　培养过程中保持持续振荡或搅拌,使藻细胞处于悬浮状态.６􀆰２􀆰３　从保种培养中分离并接种一定量藻细胞至新配制无菌的液体培养基中(接种藻细胞浓度为５􀆰０×１０３个/mL~５􀆰０×１０４个/mL),摇匀后在试验条件下培养３d~４d使其达到对数生长状态.近头状尖胞藻以外的其他藻种,需根据具体藻种确定接种藻细胞浓度和达到对数生长所需的时间.６􀆰２􀆰４　达到对数生长状态的藻液可用于试验,也可接种至新配制的无菌液体培养基中,继续进行预培养.每次转接前应通过镜检确定培养液中藻细胞形态、颜色及生长状态是否正常.当藻类培养液中含有异常细胞时,不应继续培养和用于试验.６􀆰３　操作要求保种培养和预培养过程中,所有操作应在无菌条件下进行,以免受到细菌、真菌和其他藻类的污染.７　记录资料对每批次保种培养、预培养的藻,实验室均应保存完整的引入、培养记录,相关原始记录表格设计见附录C.主要记录资料包括:———引入与验收记录;———保种培养记录;———预培养记录;———培养基配制记录;———水质检测记录;———环境条件等.３NY/T４１９５􀆰６—２０２２附　录　A(资料性)生物学背景与形态学特征　A􀆰１　生物学背景近头状尖胞藻(Raphidocelissubcapitata)是国际上藻类毒性测试的模式藻种,属绿藻门环藻目月牙藻科.曾用名为“近头状伪蹄形藻”(Pseudokirchneriellasubcapitata).过去该藻株用于生态毒理学测试时常被称为羊角月牙藻(Selenastrumcapricornutum).在实验室内２１℃、７０μE/(m２􀅰s)持续光照条件下比生长速率为１􀆰５/d~１􀆰７/d.A􀆰２　形态学特征近头状尖胞藻的形态学特征见图A􀆰１.其形状弯曲,似羊角形,细胞末端增厚近头状,大小为(８μm~１４μm)×(２μm~３μm),体积约为４０μm３.图A􀆰１　近头状尖胞藻的形态学特征４NY/T４１９５􀆰６—２０２２附　录　B(资料性)常用培养基配方　OECD培养基配方见表B􀆰１,AAP培养基配方见表B􀆰２.表B􀆰１　OECD培养基配方储备液组分储备液浓度,g/L培养基中的含量,mg/LANH４Cl１􀆰５１５􀆰０MgCl２􀅰６(H２O)１􀆰２１２􀆰０CaCl２􀅰２(H２O)１􀆰８１８􀆰０MgSO４􀅰７(H２O)１􀆰５１５􀆰０KH２PO４０􀆰１６１􀆰６０BFeCl３􀅰６(H２O)０􀆰０６４０􀆰０６４Na２EDTA􀅰２(H２O)０􀆰１０００􀆰１００CH３BO３０􀆰１８５０􀆰１８５MnCl２􀅰４(H２O)０􀆰４１５０􀆰４１５ZnCl２０􀆰００３００􀆰００３０CoCl２􀅰６(H２O)０􀆰００１５０􀆰００１５Na２MoO４􀅰２(H２O)０􀆰００７００􀆰００７０CuCl２􀆰２(H２O)０􀆰００００１０􀆰００００１DNaHCO３５０􀆰０５０􀆰０　　储备液A和C经高压灭菌(１２０℃,１５min)或０􀆰２２μm无菌滤膜过滤后,于冷藏(２℃~８℃)、黑暗条件下可保存６个月;储备液B和D经０􀆰２２μm无菌滤膜过滤后,于冷藏(２℃~８℃)、黑暗条件下可保存１个月.制备１LOECD培养基:向约９００mL无菌蒸馏水或去离子水中分别加入１０mL储备液A、１mL储备液B、１mL储备液C及１mL储备液D,用０􀆰１mol/L或１mol/LHCl或NaOH调节pH为７􀆰５±０􀆰１,用无菌蒸馏水或去离子水定容至１L.培养基应提前１d~２d制备,并在使用前测定pH,必要时,用０􀆰１mol/L或１mol/LHCl或NaOH进行调节.表B􀆰２　AAP培养基配方序号组分储备液浓度,g/L培养基中的含量,mg/LANaHCO３１􀆰５０１５􀆰０BNaNO３２􀆰５５２５􀆰５CMgCl２􀅰６(H２O)１􀆰２１６１２􀆰１６DCaCl２􀅰２(H２O)０􀆰４４１４􀆰４１EMgSO４􀅰７(H２O)１􀆰４６１４􀆰６FK２HPO４０􀆰１０４４１􀆰０４４GFeCl３􀅰６(H２O)０􀆰１６００􀆰１６０Na２EDTA􀅰２(H２O)０􀆰３０００􀆰３００H３BO３０􀆰１８６０􀆰１８６MnCl２􀅰４(H２O)０􀆰４１５０􀆰４１５ZnCl２０􀆰００３２７０􀆰００３２７CoCl２􀅰６(H２O)０􀆰００１４３０􀆰００１４３Na２MoO４􀅰２(H２O)０􀆰００７２６０􀆰００７２６CuCl２􀆰２(H２O)０􀆰００００１２０􀆰００００１２　　储备液A、储备液G经０􀆰２２μm无菌滤膜过滤后,于冷藏(２℃~８℃)、黑暗条件下可保存１个月;储备液B~F经高压灭菌(１２０℃,１５min)或０􀆰２２μm无菌滤膜过滤后,于冷藏(２℃~８℃)、黑暗条件下可保存６个月.制备１LAPP培养基:向约９００mL无菌蒸馏水或去离子水中分别加入１０mL储备液A~F及１mL储备液G,用０􀆰１mol/L或１mol/LHCl或NaOH调节pH为７􀆰５±０􀆰１,用无菌蒸馏水或去离子水定容至１L.培养基应提前１d~２d制备,并在使用前测定pH,必要时,用０􀆰１mol/L或１mol/LHCl或NaOH进行调节.５NY/T４１９５􀆰６—２０２２附　录　C(资料性