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ICS11.020CCSC05团体标准T/CRHA007—2022健康献血者的单个核细胞资源储存规范第4部分：单个核细胞的分离、处理与储存SpecificationformononuclearcellresourcestorageinhealthyblooddonorsPart4：Isolation,processingandcryopreservationofmononuclearcells2022-06-15发布2022-07-01实施中国研究型医院学会 发布T/CRHA007-2022I目次前言............................................................................II引言...........................................................................III1范围.................................................................................12规范性引用文件.......................................................................13术语和定义...........................................................................14基本原则.............................................................................15血液分离前准备工作...................................................................16分离与处理...........................................................................27记录.................................................................................4参考文献.......................................................................5T/CRHA007-2022II前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件是《健康献血者的单个核细胞资源储存规范》的第4部分。考虑到本文件中的某些条款可能涉及专利，中国研究型医院学会不负责对任何该类专利的鉴别。本文件由中国研究型医院学会临床数据与样本资源库专业委员会提出。本文件由中国研究型医院学会归口。本文件起草单位：唐颐控股（深圳）有限公司、国家卫生健康委科学技术研究所国家人类遗传资源中心、解放军总医院临床生物样本中心、中国医学科学院血液病医院（中国医学科学院血液学研究所）、天津经济技术开发区唐颐细胞智造与神经创伤修复研究院、解放军总医院医学创新研究部创伤修复与组织再生研究中心、北京唐颐惠康生物医学技术有限公司、新乡医学院干细胞与生物治疗中心、深圳华大基因细胞科技有限责任公司、唐颐惠康（深圳）生物医学技术有限公司、广州金域医学检验集团股份有限公司、深圳知因细胞生物科技有限公司、北京艾颐生物科技有限公司。本文件主要起草人：徐绍坤、曹毓琳、李国喜、王魁星、万桦、田亚平、赵秀梅、贺媛、程世翔、马士卉、孙晓艳、林俊堂、周红梅、徐驰、梁文涛、江婧婧、李霞云。T/CRHA007-2022III引言近年来，随着细胞学、免疫学、分子生物学等技术的快速发展，免疫细胞疗法已作为一种安全有效的治疗手段应用于临床，在肿瘤综合治疗中的作用尤为突出，成为继手术、化疗和放疗之后的第四大治疗肿瘤较为有效的方法。当前，用于治疗的免疫细胞主要来自患者自体外周血分离的单个核细胞经过体外的诱导扩增或工程化改造回输人体，这使得免疫细胞疗法在质量、数量和成本上成为制约其产业化应用的瓶颈。健康人外周血中的单个核细胞资源具有极高的再利用价值。以往的采供血处理，将其作为医疗废弃物进行处理，近些年，随着细胞生物技术发展和临床研究结果显示，人的机体免疫力随着年龄而逐步衰减，尤其是外周血中的免疫细胞的成分和功能随着年龄的增长而变化。在青年阶段的健康人员的外周血中的免疫细胞活性最强，借鉴于输血医学的理论基础，如何将该类细胞进行纯化并保存，为未来诸多免疫疗法提供丰富的细胞资源，成为国内外研究的热点。《健康献血者的单个核细胞资源储存规范》旨在规范健康献血者的单个核细胞资源储存活动，拟由八个部分构成：——第1部分：知情同意与供者筛查。——第2部分：采集与运输。——第3部分：供者血液样本检测。——第4部分：单个核细胞的分离、处理与储存。——第5部分：单个核细胞产品质量评价与放行。——第6部分：细胞资源储存设施的设计与建设。——第7部分：细胞资源储存设施设备的运行维护。——第8部分：数据电子信息化的管理。通过对健康献血者的单个核细胞资源储存过程中的知情同意与供者筛查、采集、运输、样本检测、分离、处理、储存、产品质量评价与放行、储存设施的设计与建设、储存设施设备的运行维护以及数据电子信息化管理等进行规范，为从事单个核细胞资源储存业务的单位提供完整的参考。T/CRHA007-20221健康献血者的单个核细胞资源储存规范第4部分：单个核细胞的分离、处理与储存1范围本文件规定了基于健康献血供者提供的外周血中的单个核细胞的分离、处理与储存基本原则、血液分离前准备工作、分离与处理以及记录要求。本文件适用于公共库健康供者单个核细胞的分离、处理与储存。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB50457医药工业洁净厂房设计规范T/CMBA011—2020人外周血单个核细胞的采集、分离和保存3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。单个核细胞peripheralbloodmononuclearcell,PBMC外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞和其他少量细胞（造血干细胞等）。[来源：T/CMBA011—2020，3.1]4基本原则采用开放式分离操作时，外周血单个核细胞的分离和处理应至少在GB50457中洁净度等级为C级背景下的A级环境中完成。采用多联袋的全封闭分离操作时，外周血单个核细胞的分离和处理应至少在GB50457中洁净度等级为D级背景下的环境中完成。外周血采集抗凝剂宜优先采用肝素类抗凝剂。外周血在进行分离处理前，其保存时限应不超过12h。外周血的分离宜采用密度梯度离心法，可采用开放式分离或密闭分离系统。5血液分离前准备工作环境确认：洁净室和洁净工作台或生物安全柜应经紫外灯灭菌30min，并启动净化风机和空调系统自净20min以上。工作人员核对血液样本与采集信息内容的一致性，用75%的乙醇对采血袋外表面自下而上进行清洁消毒，并放置传递窗自净15min后，传入分离、处理区域。T/CRHA007-20222物料准备：取出所需的试剂及耗材放置物料推车上，放置于洁净工作台或生物安全柜旁边，待用。核查确认所用试剂及耗材的批号是否在有效期内。冻存液准备：自制冻存液宜采用含1%人血白蛋白和10%二甲亚砜（DMSO），需经验证符合外周血单个核细胞冻存要求。使用前确认微生物培养72h以上结果为阴性；商品化的细胞冻存液使用前应核查确认合格证和有效期，必要时需抽检微生物检测。6分离与处理开放式操作模式下的血浆及血细胞分离与处理6.1.1在洁净工作台或生物安全柜内将全血血袋中的外周血转移到一次性无菌离心管中，将用完的血袋热合，并2℃～8℃条件下留存7天，微生物检测无异常后按照医疗废弃物处置。6.1.2将离心管中血液混匀后取0.5mL样本，进行全血计数。取1.5mL全血留样，送检“微生物限度”。6.1.3第一步离心：在室温条件（18℃～25℃）下、800g水平离心10min。6.1.4血浆分离：离心完毕后，吸取上层血浆层并转移到一次性无菌转移袋中，贴上血浆编码，4℃条件下暂存。6.1.5下层血细胞稀释：用PBS或0.9%的生理盐水按照1:1体积比，稀释血细胞层，轻轻吹打混匀。6.1.6铺层加样：将稀释的血细胞层缓慢匀速地加入到淋巴细胞分离液上方，两者比例约为1:1，铺层的整个过程都应注意不能打破淋巴分离液与血液样本的分界面。6.1.7第二次离心：在室温条件（18℃～25℃）下、800g水平离心20min，离心速度缓升缓降。6.1.8单个核细胞提取：离心完毕后，离心管内出现明显分层，由下到上分别为红细胞层、淋巴细胞分离液层、单个核细胞层、血浆生理盐水层；小心吸取单个核细胞层转移至一次性无菌离心管中，补充PBS或0.9%的生理盐水，细胞悬液与PBS或生理盐水比例大约1:3，混匀。6.1.9第三次离心：洗涤离心，在室温条件（18℃～25℃）下、800g水平离心10min。6.1.10细胞混悬液制备：离心完毕后弃上清，留取细胞沉淀，加入PBS或0.9%的生理盐水定容，重悬并混匀。取样并进行细胞活率及数量的计算。6.1.11第四次离心：洗涤离心，重复6.1.9的条件再次离心。多联袋的全密闭分离系统下的血浆及血细胞分离与处理6.2.1采血袋称重：取含有外周血的采血袋，热合去除采血针头后，用电子天平称量外周血的重量，计算外周血采血量。6.2.2预灌装分离液：通过无菌接管机将淋巴细胞分离液袋子与多连袋主管连接，转移淋巴细胞分离液至分离袋中。6.2.3血液铺层：采用含有滤网的输血器，通过无菌接管机将采血袋同多连袋主管连接，打开调节阀门，让血液缓慢流入已预装淋巴细胞分离液的分离袋中，在不破坏液面的前提下平铺于分离液上方，形成预分离层。通过热合机，将输血器及连接的采血袋高频热合熔断去除。6.2.4离心分离：将分离袋及多联袋轻柔装载于离心机适配器中，保持血袋竖立状态，设置离心参数为离心力780g，时间20min，加速档位7，减速档位4，室温条件下（18℃～25℃）离心。6.2.5离心完毕后，动作缓慢轻柔地将分离袋竖直向上提起，放置分解层面被破坏，肉眼可见自上而下五层分层，依次为血浆层、环状乳白色单个核细胞层（白膜层）、透明分离液层、粒细胞层和红细胞层。T/CRHA007-202236.2.6去血浆、收集细胞：使用分浆夹分离血浆。将分离袋缓慢放置于分浆夹上，打开多联袋中的血浆袋的调速阀门，缓慢将血浆层转移入血浆袋。关闭血浆袋调速阀门，打开细胞收集袋的调速阀门，将环状乳白色单个核细胞层（白膜层），缓慢转移至细胞收集袋中，关闭细胞收集袋调速阀门。用高频热合机将血浆袋及管道热合去除。液体转移操作宜在30秒内完成，避免分层被破坏。6.2.7灌清洗液：将0.9%的氯化钠注射液袋子连接一次性无菌输液器，通过无菌接管机与多联袋主管连接，打开细胞收集袋调速阀门，缓慢注入100mL的0.9%氯化钠注射液，关闭细胞收集袋调速阀门，用高频热合机将0.9%的氯化钠注射液袋子的输血器高频热合去除。轻柔混匀细胞收集袋。6.2.8细胞首次洗涤：将细胞收集袋及多联袋竖立放置于离心机适配器中，设置离心参数为，离心力1500g，时间6min，加速档位9，减速档位7，室温条件下（18℃～25℃）离心。离心后，放置于血浆夹上，将洗涤液转移至洗涤液收集袋中，关闭调速阀门。6.2.9细胞二次洗涤：参照6.2.7进行第二次细胞灌清洗液。6.2.10细胞取样计数：细胞重悬重复后，将细胞悬液挤压至细胞收集袋主管的调速阀门上方后，使用热合机高频热合后，将样品辫剪去送检计数，并测定细胞活率。6.2.11细胞二次离心收获，参照6.2.8的操作离心收获细胞