TCRHA 002-2021 人多能干细胞来源的小细胞外囊泡

ICS07.080A40团体标准T/CRHA002—2021————————————————————————————————————————人多能干细胞来源的小细胞外囊泡Humanpluripotentstemcellderivedsmallextracellularvesicles2021-12-28发布中国研究型医院学会发布2022-1-1实施T/CRHA002—2021目次前言...............................................................................................................................................Ⅰ1范围.................................................................................................................................................12规范性引用文件.............................................................................................................................13术语、定义及缩略语.....................................................................................................................14技术要求.........................................................................................................................................25检测方法.........................................................................................................................................36检验规则.........................................................................................................................................47包装、使用说明、标签、储存及运输.........................................................................................48废弃物处理.....................................................................................................................................5附录A（规范性）人多能干细胞的培养体系..................................................................................6附录B（规范性）人多能干细胞培养上清的收集方法.................................................................7附录C（规范性）小细胞外囊泡形态检测方法（透射电镜观察法）.........................................8附录D（规范性）小细胞外囊泡数量检测方法（纳米流式检测法)...........................................9附录E（规范性）小细胞外囊泡粒径检测方法（纳米流式检测法）.......................................11附录F（规范性）小细胞外囊泡蛋白检测方法（蛋白印迹法）...............................................12附录G（规范性）小细胞外囊泡数量与蛋白量比值计算方法...................................................13附录H（规范性）促进细胞增殖检测方法（CCK-8法）............................................................14T/CRHA002—2021I前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由中国研究型医院学会细胞外囊泡研究与应用专业委员会提出本文件由中国研究型医院学会归口。本文件起草单位：上海交通大学、南方医科大学、中山大学、江苏大学、清华大学、厦门大学、空军军医大学、浙江大学、东南大学。本文件主要起草人：汪泱、郑磊、王前、付清玲、钱晖、许文荣、尹航、邓志锋、李海燕、颜晓梅、郝晓柯、李莉、陶志华、刘必成、李青、李博。T/CRHA002—20211人多能干细胞来源的小细胞外囊泡1范围本文件规定了生产人多能干细胞来源的小细胞外囊泡的技术要求、检测方法、检验规则、包装、使用说明、标签、储存及运输和废弃物处理要求。本文件适用于人多能干细胞来源的小细胞外囊泡的生产与检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过本文件的规范性引用而成为本文件必不可少的条款。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法WS213丙型肝炎诊断WS273梅毒诊断WS293艾滋病和艾滋病病毒感染诊断标准WS299乙型病毒性肝炎诊断标准T/CSCB0001干细胞通用要求T/CSCB0002人胚干细胞T/CSCB0005人诱导多能干细胞中华人民共和国药典全国临床检验操作规程3术语、定义及缩略语3.1.术语及定义下列术语及定义适用于本文件。3.1.1.人多能干细胞humanpluripotentstemcell具有在体外无限地自我更新和向三胚层分化潜能的干细胞，包括人胚干细胞和人诱导多能干细胞。3.1.2.人诱导多能干细胞humaninducedpluripotentstemcell由人体细胞经重编程而获得的具有自我更新能力和向三胚层细胞分化潜能的一种干细胞。3.1.3.人胚干细胞humanembryonicstemcell可在体外无限地自我更新，并且具有向三胚层细胞分化潜能的，源自人着床前胚胎中未分化的初始细胞。T/CRHA002—202123.1.4.小细胞外囊泡smallextracellularvesicles由细胞主动分泌的具有双层膜结构的直径小于200nm的微小囊泡。3.2.缩略语下列缩略语适用于本文件。HBV——乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus）HCMV——人巨细胞病毒（HumanCytomegalovirus）HCV——丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus）HEBV——人类疱疹病毒（HumanEpstein-BarrVirus）HESC——人胚干细胞（humanEmbryonicStemCell）HiPSC——人诱导多能干细胞（humaninducedPluripotentStemCell）HIV——人类免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus）hPSC——人多能干细胞（humanPluripotentStemCell）HTLV——人类嗜T细胞病毒（HumanT-lymphotropicVirus）sEVs——小细胞外囊泡（smallExtracellularVesicles）TP——梅毒螺旋体（TreponemaPallidum）4技术要求4.1.原材料和辅料4.1.1.生产人多能干细胞来源的小细胞外囊泡的过程中，使用的原材料和辅料应符合T/CSCB0001、T/CSCB0002、T/CSCB0005要求。4.1.2.生产人多能干细胞来源的小细胞外囊泡的过程中，人多能干细胞的培养体系见附录A。4.2.关键质量属性4.2.1.人多能干细胞小细胞外囊泡生产过程的前、中、后，人多能干细胞的关键质量属性分别完全符合T/CSCB0002和T/CSCB0005文件规定的标准。4.2.2.小细胞外囊泡4.2.2.1.形态透射电镜下应呈现不聚团的具有清晰膜结构的茶托状或杯状结构，边缘清晰。4.2.2.2.粒径应分布在小于200nm范围内，且在范围内存在粒径峰值。4.2.2.3.标志蛋白小细胞外囊泡表面标志物CD9、CD81、CD63中的任意两个表达阳性；小细胞外囊泡内部标志物TSG-101、Alix中的任意一个表达阳性。4.2.2.4.纯度T/CRHA002—20213小细胞外囊泡阴性标志物GM130或Calnexin应为阴性；小细胞外囊泡数量与蛋白量比值不低于1×108个颗粒/微克蛋白。4.2.2.5.生物活性能促进体外培养的血管内皮细胞和成纤维细胞增殖。4.2.2.6.微生物真菌、细菌、支原体、HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、HCMV、TP应为阴性。HBV、EBV缩略语4.3.过程控制应记录小细胞外囊泡的分离方法。5检测方法5.1.人多能干细胞按照T/CSCB0002和T/CSCB0005文件规定的关键质量属性标准进行检测。5.2.人多能干细胞培养上清的收集按照附录B的方法收集。5.3.小细胞外囊泡形态按照附录C的方法检测。5.4.小细胞外囊泡数量按照附录D的方法检测。5.5.小细胞外囊泡粒径按照附录E的方法检测。5.6.小细胞外囊泡标志蛋白按照附录F的方法检测。5.7.小细胞外囊泡纯度5.7.1.小细胞外囊泡数量与蛋白量比值按照附录G的方法计算。5.7.2.小细胞外囊泡阴性和阳性标志物按照附录F的方法检测。5.8.小细胞外囊泡生物活性5.8.1.促进血管内皮细胞增殖T/CRHA002—20214按照附录H的方法检测。5.8.2.促进成纤维细胞增殖按照附录H的方法检测。5.9.微生物微生物检验方法见表1。表1：微生物检验方法。项目检验方法真菌按照《中华人民共和国药典》中“1101无菌检查法”项检测细菌按照《中华人民共和国药典》中“1101无菌检查法”项检测支原体按照《中华人民共和国药典》中“3301支原体检查法”项检测HIV按照WS293核酸法检测HBV按照WS299核酸法检测HCV按照WS213核酸法检测HTLV按照《全国临床检验操作规程》核酸法检测EBV按照《全国临床检验操作规程》核酸法检测HCMV按照《全国临床检验操作规程》核酸法检测TP按照WS273核酸法检测外源病毒因子检测按照《中华人民共和国药典》中“3302外源病毒因子检查法”项检测6检验规则6.1.出厂检验6.1.1.在同一细胞来源的同一生产周期中的同一生产线、同一细胞代次、同一工艺制备出来的产品为一批。6.1.2.在同一批的产品中随机抽取3个最小包装单元进行检测。6.1.3.每批产品均应进行出厂检验，并附检验报告。6.1.4.出厂检验的项目须包括4.2关键质量属性规定的所有项目。6.2.复核检验根据产品需要，应由专业检验机构/实验室进行复核检验。6.3.判定规则6.3.1.出厂检验项目全部符合4.2关键质量属性规定，即被判为合格产品；有1项及以上不符合4.2规定，则被判为不合格产品。6.3.2.复核检验项目全部符合4.2关键质量属性规定，即被判为合格产品；有1项及以上不符合4.2规定，则被判为不