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书书书犐犆犛６５．０２０．０１犆犆犛犅１６中华人民共和国国家标准犌犅／犜４０４５７—２０２１咖啡浆果炭疽病菌检疫鉴定方法犇犲狋犲犮狋犻狅狀犪狀犱犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿犽犪犺犪狑犪犲犑．犕．犠犪犾犾犲狉牔犅狉犻犱犵犲２０２１０８２０发布２０２２０３０１实施国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会发布书书书前 言 本文件按照ＧＢ／Ｔ１．１—２０２０《标准化工作导则 第１部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国植物检疫标准化技术委员会（ＳＡＣ／ＴＣ２７１）提出并归口。本文件起草单位：宁波检验检疫科学技术研究院、中国科学院微生物研究所、中华人民共和国天津海关。本文件主要起草人：段维军、蔡磊、刘芳、李雪莲、张慧丽、赵鹏、廖芳、陈先锋。Ⅰ犌犅／犜４０４５７—２０２１咖啡浆果炭疽病菌检疫鉴定方法１ 范围 本文件描述了咖啡浆果炭疽病菌形态学和分子生物学特征的鉴定检测方法。本文件适用于携带咖啡浆果炭疽病菌的植物及其产品中咖啡浆果炭疽病菌的检测。２ 规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。３ 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。４ 分类信息中文名：咖啡浆果炭疽病菌学名：犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿犽犪犺犪狑犪犲Ｊ．Ｍ．Ｗａｌｌｅｒ＆Ｂｒｉｄｇｅ分类地位：真菌界（Ｆｕｎｇｉ），子囊菌门（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ），盘菌亚门（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ），粪壳菌纲（Ｓｏｒｄａｒｉｏｍｙｃｅｔｅｓ），肉座菌亚纲（Ｈｙｐｏｃｒｅｏｍｙｃｅｔｉｄａｅ），小丛壳目（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａｌｅｓ），小丛壳科（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａｃｅａｅ），刺盘孢属（犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿）。分布、寄主、传播途径等信息见附录Ａ。５ 鉴定原理根据咖啡浆果炭疽病菌在寄主植物上的症状，抽取可疑样品进行病原菌分离培养，按照病原菌的形态特征和实时荧光ＰＣＲ特异性反应进行鉴定。６ 仪器设备、器具、试剂和培养基６．１ 仪器设备和器具高压灭菌锅、显微镜、解剖镜、天平、水浴锅、纯水仪、涡旋振荡器、高速冷冻离心机、冰箱、生化培养箱、实时荧光ＰＣＲ仪、紫外分光光度计、微量移液器（０．１μＬ～２．５μＬ、１μＬ～１０μＬ、１０μＬ～５０μＬ、２０μＬ～２００μＬ、１００μＬ～１０００μＬ）、研钵、锥形瓶、培养皿、载玻片、盖玻片、灭菌滤纸。６．２ 试剂十六烷基三甲基溴化铵（ＣＴＡＢ）提取液（２％ＣＴＡＢ，１．４ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，２０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ·ＨＣｌｐＨ８．０）、三羟甲基氨基甲烷（Ｔｒｉｓ）饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、７５％乙醇、ＲＮＡ酶、超纯水、实时荧光聚合酶链式反应（ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ）反应预混液：２×犜犪狇ＭａｎＵｎｉｖｅｒｓａｌ１犌犅／犜４０４５７—２０２１ＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（宜使用，亦可自行配制）。除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。６．３ 培养基麦芽汁培养基（ＭＥＡ）：麦芽汁２０ｇ，蛋白胨３ｇ，琼脂２０ｇ，加蒸馏水配制１Ｌ。配成溶液后１２１℃下灭菌２０ｍｉｎ。马铃薯葡萄糖琼脂培养基（ＰＤＡ）：马铃薯２００ｇ，葡萄糖２０ｇ，琼脂粉２０ｇ，加蒸馏水配制１Ｌ。配成溶液后１２１℃下灭菌２０ｍｉｎ。７ 检疫鉴定７．１ 分离培养切取发病材料病健交界处的植物组织（约０．３ｃｍ×０．３ｃｍ），用７５％乙醇浸泡１ｍｉｎ进行表面消毒，无菌水冲洗３次后置于灭菌滤纸上，吸干水分后放置于倒有麦芽汁培养基（ＭＥＡ）的培养皿中。培养皿放置在温度为２５℃条件下光照培养箱中培养（光照和黑暗各１２ｈ交替）。培养４ｄ～６ｄ后，挑取可疑菌落边缘的菌丝进行纯化培养。７．２ 形态学观察显微镜观察孢子的形态特征、产孢方式。观察记录菌落的直径、颜色、分生孢子和附着胞的形成情况等（见图Ａ．２）。７．３ 犇犖犃制备ＤＮＡ制备按照附录Ｂ的方法提取。７．４ 犇犖犃纯度与浓度的测定用紫外分光光度计测定ＤＮＡ的纯度与浓度，分别读取２６０ｎｍ和２８０ｎｍ处的吸收值，计为ＯＤ２６０、ＯＤ２８０。ＤＮＡ的纯度ＯＤ２６０／ＯＤ２８０比值应为１．７～１．９，ＤＮＡ的浓度为５０倍的ＯＤ２６０（μｇ／ｍＬ）。ＤＮＡ的浓度与纯度应符合实时荧光聚合酶链式反应（ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ）检测的要求。７．５ 实时荧光犘犆犚检测实时荧光聚合酶链式反应（ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ）方法按照附录Ｃ的方法检测。８ 鉴定特征８．１ 症状该病害可以发生在咖啡树生长的所有阶段，主要危害咖啡浆果，造成果实脱落，偶尔侵染叶片。浆果表面初时呈现近圆形水渍状小斑点，后病斑变成凹陷，暗褐色至灰黑色大病斑，其上长出粉红色黏液状物。病叶上可见褐色炭疽状病斑，其上有许多黑色小点（病原菌的分生孢子）排列成同心轮纹（见图Ａ．１）。８．２ 鉴定特征在温度为２５℃下，咖啡浆果炭疽菌培养物在２％麦芽汁培养基（ＭＥＡ）平板上生长７ｄ后，菌落直２犌犅／犜４０４５７—２０２１径可达１４ｍｍ～２８ｍｍ，正面灰色至深橄榄灰色，背面深绿色。继代培养的菌落的颜色发生变化，多为灰白色或棕色。分生孢子着生于菌丝上，直立，圆柱形，无分隔，两端钝圆，（１２．５μｍ～１９μｍ）×（４μｍ～５μｍ）。附着胞浅褐色至褐色，圆形或不规则，（８μｍ～９．５μｍ）×（５．５μｍ～６．５μｍ）（见图Ａ．２）。８．３ 实时荧光犘犆犚鉴定在阴性对照、空白对照正常的情况，则有如下判定：———样品无Ｃｔ值并且无扩增曲线，判定为阴性；———样品Ｃｔ值≤３５．０，且出现典型的扩增曲线，判定为阳性；———样品Ｃｔ值在３５．０～４０．０之间时，应重新提取样品ＤＮＡ进行扩增检测。重做Ｃｔ值大于４０，判为阴性；否则判为阳性；———样品Ｃｔ值大于４０时，判定为阴性。９ 结果判定若症状明显符合８．１鉴定特征，且培养物培养特征符合８．２鉴定特征，判定为检出咖啡浆果炭疽病菌。若症状不明显，但培养物培养特征符合８．２鉴定特征，且实时荧光ＰＣＲ检测结果为阳性，判定为检出咖啡浆果炭疽病菌。１０ 样品保存、记录与复核１０．１ 样品保存、记录保存样品应置于２℃～８℃冰箱妥善保存，对检出咖啡浆果炭疽病菌的样品应至少保存６个月。菌株保存于４℃冷藏箱，核酸样品保存于－２０℃或－８０℃冰箱。以备复检、谈判和仲裁。分离到的咖啡浆果炭疽病菌应接种于马铃薯葡萄糖琼脂（ＰＤＡ）培养基中妥善保存。记录包括：样品的来源、种类、采样时间、检测时间、地点、方法、结果等，并有试验人员的签字。实时荧光ＰＣＲ要有检测阳性结果照片。１０．２ 复核由指定的单位或人员负责，主要考察试验原始数据记录及实时荧光ＰＣＲ结果等资料的完整性和真实性，必要时进行复核试验。３犌犅／犜４０４５７—２０２１附 录 犃（资料性）咖啡浆果炭疽病菌基本信息犃．１ 地理分布非洲：安哥拉、布隆迪、喀麦隆、中非共和国、刚果（金）、埃塞俄比亚、肯尼亚、马拉维、莫桑比克、卢旺达、南非、坦桑尼亚、乌干达、赞比亚、津巴布韦。中美洲：古巴。欧洲：意大利。犃．２ 寄主咖啡，包括小粒种犆狅犳犳犲犪犪狉犪犫犻犮犪、中粒种犆狅犳犳犲犪犮犪狀犲狆犺狅狉犪和大粒种犆狅犳犳犲犪犾犻犫犲狉犻犮犪。犃．３ 传播途径染病浆果为初侵染源，也可借助人类耕作活动、鸟类、昆虫、雨水等进行传播，远距离传播通过带病植株相关贸易进行传播。犃．４ 危害情况咖啡浆果炭疽病是一种毁灭性的病害，主要危害小粒种咖啡的绿色浆果和叶片，极易造成果实脱落，并可使咖啡果实产量损失５０％～８０％。浆果表面初时呈现近圆形水渍状小斑点，后病斑变成凹陷，暗褐色至灰黑色大病斑，其上长出粉红色黏液状物（见图Ａ．１）。图犃．１ 咖啡浆果炭疽病菌危害咖啡叶片和浆果的病害症状（引自犠犪犾犾犲狉犲狋犪犾．１９９３）犃．５ 形态特征咖啡浆果炭疽病菌培养物形态特征图见图Ａ．２。４犌犅／犜４０４５７—２０２１ 说明：Ａ～Ｂ———附着胞；Ｃ———分生孢子；Ｄ～Ｆ———不同菌株在马铃薯葡萄糖琼脂（ＰＤＡ）上培养１０ｄ的菌落形态，上为正面、下为反面。注：Ｃ上标尺为２０μｍ，适用于Ａ～Ｂ。图犃．２ 咖啡浆果炭疽病菌的形态特征（引自犠犲犻狉犲狋犪犾．２０１２）５犌犅／犜４０４５７—２０２１附 录 犅（规范性）十六烷基三甲基溴化铵（犆犜犃犅）提取犇犖犃方法犅．１ 收集培养分离得到的菌丝或植物材料放入１．５ｍＬ离心管中，加入０．２ｇ石英砂或４粒～５粒玻璃珠和１００μＬ十六烷基三甲基溴化铵（ＣＴＡＢ）抽提液，用破碎仪或无菌玻璃杵碾碎菌丝体或植物材料。犅．２ 加入５００μＬ６５℃预热的ＣＴＡＢ抽提液，颠倒混匀后于６５℃水浴０．５ｈ～１ｈ。犅．３ 冷却至室温后，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液至另一离心管中。犅．４ 加入１／２体积（３００μＬ）的三羟甲基氨基甲烷（Ｔｒｉｓ）饱和酚及１／２体积（３００μＬ）的氯仿∶异戊醇（２４∶１），颠倒混匀后静置至其开始分层。犅．５ １２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液至另一离心管中。犅．６ 可重复Ｂ．４至Ｂ．５步２次～３次，视两相界面处杂质的多少而定。犅．７ 加入等体积氯仿∶异戊醇（２４∶１），轻轻颠倒混匀。犅．８ １２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液至另一离心管中。犅．９ 向上清液中加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混合均匀后于４℃或－２０℃沉淀１ｈ。犅．１０ １２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃去上清液，加５００μＬ７０％乙醇悬浮沉淀。犅．１１ １２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃上清，室温干燥。犅．１２ 加５０μＬ无菌水或三羟甲基氨基甲烷乙二胺四乙酸（ＴｒｉｓＥＤＴＡ，ＴＥ）缓冲液［配方：１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）１ｍＬ，０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）０．２ｍＬ，加超纯水定容至１００ｍＬ］溶解沉淀，－２０℃贮存备用。６犌犅／犜４０４５７—２０２１附 录 犆（规范性）实时荧光犘犆犚方法犆．１ 引物及探针序列正向引物ＣＫＧＦ：５′ＣＴＧＣＡＴＣＴＧＧＴＡＧＡＣＡＡＧＡＡＧＧＴ３′。反向引物ＣＫＧＲ：５′ＡＧＡＧＣＧＡＧＴＣＡＧＴＡＡＡＴＧＴＧＡＣＡＧ３′。探针ＣＫＧＰ：５′ＣＣＣＡＴＧＡＴＴＴＣＡＡＴＴＣＡＣＡＴＣＡＡＧＴＣＡＡＧ３′。犜犪狇Ｍａｎ探针（ＣＫＧＰ）采用５′末端ＦＡＭ（６ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）标记作为荧光报告染料，３′末端ＴＡＭＲＡ（６ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）标记作为荧光淬灭染料。犆．２ 反应体系ＰＣＲ扩增反应体系（总体积为２５μＬ）：２×犜犪狇ＭａｎＵｎｉｖｅｒｓａｌＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ１２．５μＬ、引物ＣＫＧＦ／ＣＫＧＲ各０．４μｍｏｌ／Ｌ、探针ＣＫＧＰ０．２μｍｏｌ／Ｌ，ＤＮＡ模板２μＬ，加入去离子水补齐２５μＬ。将反应体系混合均匀后置于荧光ＰＣＲ仪中进行反应。以咖啡浆果炭疽病菌ＤＮＡ作阳性对照、不含咖啡浆果炭疽病菌的ＤＮＡ作阴性对照、以无菌蒸馏水作空白对照，每个样品设置３个重复。犆．３ 扩增条件反应条件为：９５℃１０ｍｉｎ；然后９４℃１５ｓ，６０℃６０ｓ，共４０个循环。犌犅／犜４０４５７—２０２１书书书犌犅／犜４０４５７—２０２１参 考 文 献 ［１］ＣａｉＬ，ＨｙｄｅＫＤ，ＴａｙｌｏｒＰＷＪ，ＷｅｉｒＢＳ，ＷａｌｌｅｒＪ，ＡｂａｎｇＭＭ，ＺｈａｎｇＪＺ，ＹａｎｇＹＬ，ＰｈｏｕｌｉｖｏｎｇＳ，ＬｉｕＺＹ，ＰｒｉｈａｓｔｕｔｉＨ，ＳｈｉｖａｓＲＧ，ＭｃＫｅｎｚｉｅＥＨＣ，ＪｏｈｎｓｔｏｎＰＲ（２００９）Ａｐｏｌｙｐｈａｓｉｃａｐｐｒｏａｃｈｆｏｒｓｔｕｄｙｉｎｇ犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿．ＦｕｎｇａｌＤｉｖｅｒｓ３９：１８３２０４．［２］ＣａｎｎｏｎＰＦ，ＤａｍｍＵ，ＪｏｈｎｓｔｏｎＰＲ，ＷｅｉｒＢＳ（２０１２）犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿ｃｕｒｒｅｎｔｓｔａｔｕｓａｎｄｆｕｔｕｒｅｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ．ＳｔｕｄＭｙｃｏｌ７３：１８１２１３．［３］ＬｉｕＦ，ＷｅｉｒＢ，ＤａｍｍＵ，ＣｒｏｕｓＰＷ，ＷａｎｇＹ，ＬｉｕＢ，Ｗ