GB 31656.14-2022 食品安全国家标准 水产品中27种性激素残留量的测定 液相色谱-串联

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中华人民共和国国家卫生健康委员会食品安全国家标准水产品中27种性激素残留量的测定液相色谱-串联质谱法20中华人民共和国国家标准备案号:XXXX-XXXXICS67.120.30X31656.14—2022Nationalfoodsafetystandard—Determinationof27sexhormonesresiduesinfisheryproductsbyliquidchromatography-tandemmassspectrometricGB20220920发布--20230201--实施发布国家市场监督管理总局中华人民共和国农业农村部CCSGB31656􀆰14—2022前  言本文件按照GB/T1􀆰1—2020«标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定起草.本文件系首次发布.ⅠGB31656􀆰14—2022食品安全国家标准水产品中27种性激素残留量的测定 液相色谱G串联质谱法1 范围本文件规定了水产品中27种性激素残留量检测的制样和液相色谱G串联质谱测定方法.本文件适用于鱼、虾和蟹可食部分中己二烯雌酚、己烯雌酚、雌酮、己烷雌酚、雌二醇、雌三醇、炔雌醇、苯甲酸雌二醇、群勃龙、诺龙、雄烯二酮、勃地酮、睾酮、炔诺酮、美雄酮、甲基睾酮、康力龙、苯丙酸诺龙、丙酸睾酮、孕酮、21αG羟基孕酮、17αG羟基孕酮、甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲羟孕酮和左炔诺孕酮残留量的测定.2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T30891—2014 水产品抽样规范3 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义.4 原理试样中残留的性激素用乙酸乙酯G甲基叔丁基醚混合溶剂和乙酸乙酯依次提取,提取液经浓缩、C18固相萃取柱净化,用液相色谱G串联质谱仪测定,内标法定量.5 试剂与材料以下所用的试剂,除特别注明外均为分析纯;水为符合GB/T6682规定的一级水.5􀆰1 试剂5􀆰1􀆰1 甲醇(CH3OH):色谱纯.5􀆰1􀆰2 正己烷(C6H14):色谱纯.5􀆰1􀆰3 甲基叔丁基醚(C5H12O):色谱纯.5􀆰1􀆰4 乙酸乙酯(C4H8O2):色谱纯.5􀆰1􀆰5 冰乙酸(CH3COOH).5􀆰1􀆰6 三水乙酸钠(C2H3NaO2􀅰3H2O).5􀆰1􀆰7 氨水(NH3􀅰H2O).5􀆰2 溶液配制5􀆰2􀆰1 乙酸G乙酸钠缓冲溶液:取三水乙酸钠21􀆰5g、冰乙酸2􀆰6mL,加水适量使溶解并稀释至500mL,混匀.5􀆰2􀆰2 0􀆰02%氨水:取氨水100μL于500mL水中,混匀.临用前配制.5􀆰2􀆰3 乙酸乙酯G甲基叔丁基醚溶液:取乙酸乙酯和甲基叔丁基醚等体积混合.5􀆰3 标准品5􀆰3􀆰1 性激素:己二烯雌酚、己烯雌酚、雌酮、己烷雌酚、雌二醇、雌三醇、炔雌醇、苯甲酸雌二醇、群勃龙、1GB31656􀆰14—2022诺龙、雄烯二酮、勃地酮、睾酮、炔诺酮、美雄酮、甲基睾酮、康力龙、苯丙酸诺龙、丙酸睾酮、孕酮、21αG羟基孕酮、17αG羟基孕酮、甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲羟孕酮和左炔诺孕酮:含量≥97%,具体见附录A.5􀆰3􀆰2 内标:己烯雌酚GD8、雌酮GD2、雌二醇G13C2、甲基睾酮GD3、孕酮GD9、左炔诺孕酮GD6和甲羟孕酮GD3:含量≥97%,具体见附录A.5􀆰4 标准溶液制备5􀆰4􀆰1 标准储备液:取性激素类标准品各10mg,精密称定,分别用甲醇适量使溶解并定容于100mL棕色容量瓶,配制成浓度均为100μg/mL的标准储备液.-18℃以下保存,有效期1年.5􀆰4􀆰2 混合标准中间液:准确量取各标准储备液适量,于100mL棕色容量瓶,用甲醇稀释配制成己二烯雌酚、己烯雌酚、雌酮、群勃龙、诺龙、雄烯二酮、勃地酮、睾酮、美雄酮、甲基睾酮、苯丙酸诺龙、丙酸睾酮、孕酮、21αG羟基孕酮、17αG羟基孕酮、甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲羟孕酮浓度均为1μg/mL;己烷雌酚、雌二醇、左炔诺孕酮、炔诺酮、苯甲酸雌二醇和康力龙浓度均为2μg/mL;雌三醇和炔雌醇浓度均为4μg/mL的混合标准中间液.-18℃以下保存,有效期6个月.5􀆰4􀆰3 混合标准工作液:准确量取混合标准中间液10mL,于50mL棕色容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,配制成己二烯雌酚、己烯雌酚、雌酮、群勃龙、诺龙、雄烯二酮、勃地酮、睾酮、美雄酮、甲基睾酮、苯丙酸诺龙、丙酸睾酮、孕酮、21αG羟基孕酮、17αG羟基孕酮、甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲羟孕酮浓度均为0􀆰2μg/mL;己烷雌酚、雌二醇、左炔诺孕酮、炔诺酮、苯甲酸雌二醇和康力龙浓度均为0􀆰4μg/mL;雌三醇和炔雌醇浓度均为0􀆰8μg/mL的混合标准工作液.-18℃以下保存,有效期3个月.5􀆰4􀆰4 内标标准储备液:取同位素内标物各10mg,精密称定,分别用甲醇适量使溶解并定容于50mL棕色容量瓶,配制成浓度为200μg/mL的内标单标储备溶液.-18℃以下保存,有效期1年.5􀆰4􀆰5 混合内标工作液:分别准确量取内标储备液适量,于100mL棕色容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,配制成雌二醇G13C2浓度为2μg/mL;己烯雌酚GD8、雌酮GD2、甲基睾酮GD3、孕酮GD9、甲羟孕酮GD3和左炔诺孕酮GD6浓度均为1μg/mL的混合内标工作液.-18℃以下保存,有效期6个月.5􀆰5 材料5􀆰5􀆰1 C18固相萃取柱:500mg/3mL,或相当者.5􀆰5􀆰2 微孔尼龙滤膜:0􀆰22μm.6 仪器和设备6􀆰1 高效液相色谱G串联质谱仪:配电喷雾离子源(ESI).6􀆰2 分析天平:感量0􀆰00001g和0􀆰01g.6􀆰3 高速离心机:10000r/min.6􀆰4 涡旋混合器.6􀆰5 均质机.6􀆰6 旋转蒸发仪.6􀆰7 固相萃取装置.6􀆰8 梨形瓶:100mL.6􀆰9 超声波清洗器.6􀆰10 塑料离心管:10mL和50mL.7 试样的制备与保存7􀆰1 试样的制备按GB/T30891—2014附录B的要求制样.2GB31656􀆰14—2022a) 取均质的供试样品,作为供试试样;b) 取均质的空白样品,作为空白试样;c) 取均质的空白样品,添加适宜浓度的标准溶液,作为空白添加试样.7􀆰2 试样的保存-18℃以下保存.8 测定步骤8􀆰1 提取取试料5g(准确至±0􀆰05g),于50mL离心管中,准确加入30μL混合内标工作液和乙酸G乙酸钠缓冲液10mL,涡旋30s,加乙酸乙酯G甲基叔丁基醚溶液10mL,涡旋1min,超声10min,涡旋混合1min,于8000r/min离心8min,取上层有机相于100mL梨形瓶;残渣用乙酸乙酯10mL重复提取1次,有机相合并至梨形瓶中,于35℃水浴旋转蒸发至干.对蒸干后有油脂残留的样品,用氮气或空气将残留在油脂中的乙酸乙酯吹除干净.加入正己烷7mL溶解残留物,备用.8􀆰2 净化取C18固相萃取柱,依次用甲醇、正己烷各5mL活化.取备用液,过柱,控制流速不超过1滴/s;用正己烷10mL淋洗,吹干;用甲醇10mL洗脱,收集洗脱液,于40℃水浴旋转蒸发至干.准确加入甲醇0􀆰85mL,涡旋混合1min,再准确加入水0􀆰15mL,混合30s,8000r/min,离心6min,上清液用0􀆰22μm尼龙滤膜过滤,供液相色谱G串联质谱测定.8􀆰3 基质匹配标准工作曲线的制备分别取10μL、25μL、50μL、100μL、250μL、500μL混合标准工作溶液于5mL玻璃离心管中,分别加混合内标工作液30μL,吹干,加入经7􀆰1和7􀆰2步骤处理所得的基质空白溶液1􀆰0mL,混合1min,配制成激素浓度为2ng/mL~400ng/mL系列基质匹配标准工作液,上机测定.以标准物质特征离子色谱峰的峰面积与内标物特征离子色谱峰的峰面积比值为纵坐标、相应的浓度为横坐标,绘制基质标准工作曲线.求回归方程和相关系数.8􀆰4 测定8􀆰4􀆰1 液相色谱参考条件a) 色谱柱:XBridgeShieldRP18柱(4􀆰6mm×150mm,5μm),或相当者;b) 流速:0􀆰4mL/min;c) 进样量:20μL;d) 柱温:25℃;e) 流动相A为甲醇;流动相B为0􀆰02%氨水,梯度洗脱程序见表1.表1 梯度洗脱条件时间,minA,%B,%0􀆰085158􀆰0901015􀆰0901015􀆰197320􀆰097320􀆰1851525􀆰085158􀆰4􀆰2 质谱参考条件a) 离子源:ESI;b) 喷雾电压:3􀆰0kV;c) 离子传输管温度:350℃;3GB31656􀆰14—2022d) 鞘气流速:13􀆰3L/min;e) 辅助气流速:3􀆰3L/min;f) 碰撞气压:0􀆰1995Pa;g) 检测方式:多反应监测(MRM),27种激素及内标物多反应监测母离子、子离子、碰撞能量和扫描方式见表2.表2 27种性激素及内标物母离子、子离子、碰撞能量和扫描方式序号化合物名称扫描方式母离子m/z锥孔电压V子离子m/z碰撞能量eV内标物1己二烯雌酚ESI-264􀆰9872己烯雌酚ESI-266􀆰987236􀆰129249􀆰1∗29237􀆰130251􀆰1∗28己烯雌酚GD83己烷雌酚ESI-269􀆰2874雌酮ESI-268􀆰987134􀆰119119􀆰1∗48183􀆰145145􀆰1∗40雌酮GD25雌二醇ESI-271􀆰2876雌三醇ESI-287􀆰1877炔雌醇ESI-295􀆰187183􀆰2∗42145􀆰143145􀆰146171􀆰1∗40159􀆰135145􀆰1∗48雌二醇G13C28苯甲酸雌二醇ESI+377􀆰2126917Gα羟基孕酮ESI+331􀆰21261021Gα羟基孕酮ESI+331􀆰212611醋酸甲羟孕酮ESI+387􀆰212612醋酸氯地孕酮ESI+405􀆰212613醋酸甲地孕酮ESI+385􀆰212614甲羟孕酮ESI+345􀆰312615炔诺酮ESI+299􀆰28716康力龙ESI+329􀆰4126135􀆰110105􀆰1∗28109􀆰12397􀆰1∗23109􀆰12397􀆰1∗23123􀆰129327􀆰3∗11309􀆰314301􀆰2∗19267􀆰218224􀆰2∗2397􀆰129123􀆰1∗23231􀆰217109􀆰1∗26121􀆰13681􀆰1∗43甲羟孕酮GD317孕酮ESI+315􀆰087109􀆰12897􀆰1∗22孕酮GD918左炔诺孕酮ESI+313􀆰287109􀆰130245􀆰2∗18左炔诺孕酮GD619诺龙ESI+275􀆰28720苯丙酸诺龙ESI+407􀆰212621睾酮ESI+289􀆰28722勃地酮ESI+287􀆰287257􀆰213239􀆰2∗16257􀆰2∗16105􀆰22897􀆰220109􀆰1∗27121􀆰122135􀆰2∗13甲基睾酮GD34GB31656􀆰14—2022表2(续)序号化合物名称扫描方式母离子m/z锥孔电压V子离子m/z碰撞能量eV内标物23群勃龙ESI+271􀆰18724甲基睾酮ESI+303􀆰18725雄烯二酮ESI+287􀆰28726美雄酮ESI+301􀆰28727丙酸睾酮ESI+345􀆰2126199􀆰118253􀆰2∗23109􀆰12697􀆰1∗28109􀆰12497􀆰1∗20149􀆰212121􀆰1∗23109􀆰12997􀆰1∗30甲基睾酮GD328甲基睾酮GD3ESI+306􀆰287109􀆰2∗302

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