GB 31659.4-2022 食品安全国家标准 奶及奶粉中阿维菌素类药物残留量的测定 液相色谱-串

中华人民共和国国家卫生健康委员会食品安全国家标准奶及奶粉中阿维菌素类药物残留量的测定液相色谱-串联质谱法16中华人民共和国国家标准备案号：XXXX-XXXXＩＣＳ67.100X31659.4—2022Nationalfoodsafetystandard—Determinationofavermectinsresiduesinmilkandmilkpowderbyliquidchromatography-tandemmassspectrometricmethodGB20220920发布－－20230201－－实施发布国家市场监督管理总局中华人民共和国农业农村部CCS代替GB/T22968—2008GB３１６５９􀆰４—２０２２前　　言本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定起草.本文件代替GB/T２２９６８—２００８«牛奶和奶粉中伊维菌素、阿维菌素、多拉菌素和乙酰氨基阿维菌素残留量的测定　液相色谱Ｇ串联质谱法»,与GB/T２２９６８—２００８相比,除结构调整和编辑性改动外,主要变化如下:———标准文本格式修改为食品安全国家标准文本格式;———标准范围中增加了羊奶的检测;———标准测定物质改为各药物的残留标志物;———标准灵敏度进一步提高.本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为:———GB/T２２９６８—２００８.ⅠGB３１６５９􀆰４—２０２２食品安全国家标准奶及奶粉中阿维菌素类药物残留量的测定　液相色谱Ｇ串联质谱法１　范围本文件规定了奶及奶粉中阿维菌素类药物残留检测的制样和液相色谱Ｇ串联质谱测定方法.本文件适用于牛奶、羊奶和奶粉中阿维菌素(以阿维菌素B１a计)、伊维菌素(以２２,２３Ｇ二氢阿维菌素B１a计)、多拉菌素和乙酰氨基阿维菌素(以乙酰氨基阿维菌素B１a计)单个或多个药物的残留检测.２　规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法３　术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义.４　原理试料中残留的阿维菌素类药物,用乙腈提取,C１８固相萃取柱净化,液相色谱Ｇ串联质谱测定,基质匹配标准溶液外标法定量.５　试剂和材料５􀆰１　试剂以下所用试剂,除特别注明外均为分析纯试剂,水为符合GB/T６６８２规定的一级水.５􀆰１􀆰１　乙腈(CH３CN):色谱纯.５􀆰１􀆰２　甲醇(CH３OH):色谱纯.５􀆰１􀆰３　甲酸(CH２O２):色谱纯.５􀆰１􀆰４　三乙胺(C６H１５N).５􀆰１􀆰５　异辛烷(C８H１８).５􀆰２　溶液配制５􀆰２􀆰１　０􀆰１％甲酸乙腈溶液:取甲酸１mL,用乙腈稀释至１０００mL.５􀆰２􀆰２　０􀆰１％甲酸溶液:取甲酸１mL,用水稀释至１０００mL.５􀆰２􀆰３　淋洗溶液:取乙腈３０mL、水７０mL和三乙胺２０μL,混匀.５􀆰２􀆰４　５０％乙腈溶液:取乙腈５０mL,用水稀释至１００mL.５􀆰３　标准品阿维菌素(Avermectin,C４８H７２O１４􀅰C４７H７０O１４,CAS号:７１７５１Ｇ４１Ｇ２),含量≥９８􀆰０％;伊维菌素(IverＧmectin,C４８H７４O１４,CAS号:７０２８８Ｇ８６Ｇ７),含量≥９８􀆰０％;多拉菌素(Doramectin,C５０H７４O１４,CAS号:１１７７０４Ｇ２５Ｇ３),含量≥９４􀆰３％;乙酰氨基阿维菌素(Eprinomectin,C５０H７５NO１４,CAS号:１２３９９７Ｇ２６Ｇ２),含量≥９８􀆰０％.５􀆰４　标准溶液的制备５􀆰４􀆰１　阿维菌素类药物标准储备液:精密称取阿维菌素(以阿维菌素B１a计)、伊维菌素(以２２,２３Ｇ二氢１GB３１６５９􀆰４—２０２２阿维菌素B１a计)、多拉菌素和乙酰氨基阿维菌素(以乙酰氨基阿维菌素B１a计)标准品各约１０mg,于不同的１０mL容量瓶中,用乙腈溶解并定容至刻度,配制成浓度为１mg/mL的阿维菌素B１a、２２,２３Ｇ二氢阿维菌素B１a、多拉菌素和乙酰氨基阿维菌素B１a标准储备液.－１８℃以下保存,有效期１２个月.５􀆰４􀆰２　阿维菌素类药物标准工作液:精密量取１mg/mL的阿维菌素B１a、２２,２３Ｇ二氢阿维菌素B１a、多拉菌素和乙酰氨基阿维菌素B１a标准储备液１００μL,于不同的１０mL容量瓶中,用乙腈稀释至刻度,配制成浓度为１０μg/mL的阿维菌素B１a、２２,２３Ｇ二氢阿维菌素B１a、多拉菌素和乙酰氨基阿维菌素B１a标准工作液.－１８℃以下保存,有效期６个月.５􀆰５　材料５􀆰５􀆰１　C１８固相萃取柱:５００mg/６mL,或相当者.５􀆰５􀆰２　亲水聚四氟乙烯微孔滤膜:０􀆰２２μm.６　仪器和设备６􀆰１　液相色谱Ｇ串联质谱仪:配有电喷雾离子源(ESI).６􀆰２　分析天平:感量０􀆰００００１g和０􀆰０１g.６􀆰３　涡旋混合器.６􀆰４　高速离心机.６􀆰５　氮吹仪.６􀆰６　水平振荡器.７　试样的制备与保存７􀆰１　试样的制备取适量新鲜或解冻的空白或供试牛奶或羊奶及奶粉,混合均匀.a)　取均质后的供试样品,作为供试试样;b)　取均质后的空白样品,作为空白试样;c)　取均质后的空白样品,添加适宜浓度的标准工作液,作为空白添加试样.７􀆰２　试样的保存牛奶和羊奶:冷藏避光或－１８℃以下保存.奶粉:阴凉干燥处保存.８　测定步骤８􀆰１　提取称取牛奶或羊奶２g(准确至±０􀆰０５g)或奶粉０􀆰５g(准确至±０􀆰０１g)于５０mL离心管中,加乙腈８mL,涡旋后２００r/min水平振荡５min,８０００r/min离心８min,转移上清液至另一５０mL离心管中,加水１０mL、三乙胺２５μL,混匀,备用.８􀆰２　净化与浓缩C１８固相萃取柱依次用乙腈５mL和淋洗溶液５mL活化,取备用液过柱,用淋洗溶液５mL淋洗,抽干;再用异辛烷５mL淋洗,抽干;用乙腈５mL洗脱,收集洗脱液于１０mL试管中,于５０℃下氮气吹干.残余物中加入５０％乙腈溶液１􀆰０mL,充分溶解.过微孔滤膜后供液相色谱Ｇ串联质谱仪测定.８􀆰３　基质匹配标准曲线的制备精密量取阿维菌素类标准工作液适量,用５０％乙腈水溶液稀释成含阿维菌素B１a、２２,２３Ｇ二氢阿维菌素B１a、多拉菌素和乙酰氨基阿维菌素B１a浓度分别为０􀆰５ng/mL、１ng/mL、２ng/mL、５ng/mL、１０ng/mL、２０ng/mL、５０ng/mL、１００ng/mL和４００ng/mL的系列标准工作液(牛奶或羊奶用０􀆰５ng/mL、１ng/mL、２ng/mL、５ng/mL、１０ng/mL、２０ng/mL和５０ng/mL浓度点,奶粉用２ng/mL、２GB３１６５９􀆰４—２０２２５ng/mL、１０ng/mL、２０ng/mL、５０ng/mL、１００ng/mL和４００ng/mL浓度点),从中各取１􀆰０mL,分别加入空白试料经提取、净化和吹干后的残余物中,充分溶解,作为基质匹配标准溶液,过微孔滤膜后上机测定.以特征离子质量色谱峰面积为纵坐标、基质匹配标准溶液浓度为横坐标,绘制标准曲线.８􀆰４　测定８􀆰４􀆰１　液相色谱参考条件a)　色谱柱:C１８(５０mm×２􀆰１mm,１􀆰７μm),或性能相当者.b)　流动相:A为０􀆰１％甲酸溶液,B为０􀆰１％甲酸乙腈溶液.流动相梯度:０min~１min保持７０％B;１min~３min,７０％B线性变化到１００％B;３min~４min保持１００％B;４min~６min保持７０％B.c)　流速:０􀆰４mL/min.d)　进样量:５μL.e)　柱温:３０℃.８􀆰４􀆰２　串联质谱参考条件a)　离子源:电喷雾离子源;b)　扫描方式:正离子扫描;c)　检测方式:多反应离子监测(MRM);d)　电喷雾电压:５５００V;e)　离子源温度:５００℃;f)　辅助气１:５０psi;g)　辅助气２:５０psi;h)　气帘气:３０psi;i)　碰撞气:Medium.j)　待测药物定性、定量离子对和对应的去簇电压、碰撞能量参考值见表１.表１　待测药物定性、定量离子对和对应的去簇电压、碰撞能量参考值药物定性离子对m/z定量离子对m/z去簇电压V碰撞能量eV阿维菌素B１a８９５􀆰５＞７５１􀆰４８９５􀆰５＞４４９􀆰１８９５􀆰５＞７５１􀆰４５０６０６０２２,２３Ｇ二氢阿维菌素B１a８９７􀆰５＞７５３􀆰２８９７􀆰５＞３２９􀆰２８９７􀆰５＞７５３􀆰２５０５５７０多拉菌素９２１􀆰５＞３５３􀆰２９２１􀆰５＞４４９􀆰１９２１􀆰５＞４４９􀆰１５０７０６０乙酰氨基阿维菌素B１a９３６􀆰５＞４９０􀆰１９３６􀆰５＞３５２􀆰１９３６􀆰５＞４９０􀆰１５５７０７５８􀆰４􀆰３　测定法试样溶液的保留时间在基质匹配标准溶液保留时间的±２􀆰５％之内.试样溶液中的离子相对丰度与基质匹配标准溶液中的离子相对丰度相比,符合表２的要求.取基质匹配标准溶液和试样溶液,作单点或多点校准,按外标法,以峰面积计算.基质匹配标准溶液及试样溶液中阿维菌素类药物的峰面积均应在仪器检测的线性范围之内,超出线性范围时进行适当倍数稀释后再进行分析.基质匹配标准溶液中特征离子质量色谱图见附录A.表２　试样溶液中离子相对丰度的允许偏差范围单位为百分号相对丰度允许偏差＞５０±２０３GB３１６５９􀆰４—２０２２表２(续)相对丰度允许偏差＞２０~５０±２５＞１０~２０±３０≤１０±５０８􀆰５　空白试验取空白试料,除不添加药物外,采用完全相同的测定步骤进行平行操作.９　结果计算和表述试样中阿维菌素类药物的残留量按标准曲线或公式(１)计算.X＝C×A×V×１０００As×m×１０００(１)􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺式中:X———试样中阿维菌素类药物残留量的数值,单位为微克每千克(μg/kg);C———基质匹配标准溶液中阿维菌素类药物浓度的数值,单位为纳克每毫升(ng/mL);A———试样溶液中阿维菌素类药物的峰面积;V———溶解残余物所用溶液体积的数值,单位为毫升(mL);As———基质匹配标准溶液中阿维菌素类药物的峰面积;m———试样质量的数值,单位为克(g).１０　检测方法的灵敏度、准确度和精密度１０􀆰１　灵敏度本方法对牛奶或羊奶的检测限为０􀆰２μg/kg,定量限为０􀆰５μg/kg;对奶粉的检测限为１μg/kg,定量限为４μg/kg.１０􀆰２　准确度本方法牛奶中阿维菌素B１a在０􀆰５μg/kg~５μg/kg、２２,２３Ｇ二氢阿维菌素B１a在０􀆰５μg/kg~２０μg/kg、多拉菌素在０􀆰５μg/kg~３０μg/kg、乙酰氨基阿维菌素B１a在０􀆰５μg/kg~４０μg/kg添加浓度水平上,羊奶中阿维菌素类药物在０􀆰５μg/kg~５μg/kg添加浓度水平上,以及奶粉中阿维菌素B１a在４μg/kg~４０μg/kg、２２,２３Ｇ二氢阿维菌素B１a在４μg/kg~１６０μg/kg、多拉菌素在４μg/kg~２４０μg/kg、乙酰氨基阿维菌素B１a在４μg/kg~３２０μg/kg添加浓度水平上的回收率均为６０％~１２０％.１０􀆰３　精密度本方法批内相对标准偏差≤１５％,批间相对标准偏差≤２０％.４GB３１６５９􀆰４—２０２２附　录　A(资料性)阿维菌素类药物特征离子色谱图空白牛奶基质匹配标准溶液中阿维菌素类药物特征离子色谱图见图A􀆰１.图A􀆰１　空白牛奶基质匹配标准溶液中阿维菌素类药物特征离子色谱图(１􀆰０ng/mL)注:阿维菌素B１a特征离子(８９５􀆰５＞７５１􀆰４,８９５􀆰５＞４４９􀆰１);２２,２３Ｇ二氢阿维菌素B１a(８９７􀆰５＞７５３􀆰２,８９７􀆰５＞３２９􀆰２);多拉菌素(９２１􀆰５＞３５３􀆰２,９２１􀆰５＞４４９􀆰１);乙酰氨基阿维菌素B１a(９３６􀆰５＞４