GB 31658.23-2022 食品安全国家标准 动物性食品中硝基咪唑类药物残留量的测定 液相色谱

中华人民共和国国家卫生健康委员会食品安全国家标准动物性食品中硝基咪唑类药物残留量的测定液相色谱-串联质谱法04中华人民共和国国家标准备案号：XXXX-XXXXＩＣＳ67.050X31658.23—2022Nationalfoodsafetystandard—Determinationofnitroimidazoleresiduesinanimalderivedfoodbyliquidchromatography-tandemmassspectrometricmethodGB20220920发布－－20230201－－实施发布国家市场监督管理总局中华人民共和国农业农村部CCSGB３１６５８􀆰２３—２０２２前　　言本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定起草.本文件系首次发布.ⅠGB３１６５８􀆰２３—２０２２食品安全国家标准动物性食品中硝基咪唑类药物残留量的测定液相色谱Ｇ串联质谱法１　范围本文件规定了动物性食品中甲硝唑、羟基甲硝唑、地美硝唑和羟基地美硝唑残留量检测的制样和液相色谱Ｇ串联质谱测定方法.本文件适用于猪、牛、羊和鸡的肌肉、肝脏和肾脏组织中甲硝唑、羟基甲硝唑、地美硝唑和羟基地美硝唑残留量的测定.２　规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法３　术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义.４　原理试样中残留的硝基咪唑类药物经乙酸乙酯提取,正己烷液液萃取除脂,固相萃取柱净化,液相色谱Ｇ串联质谱检测,基质匹配内标法定量.５　试剂与材料除另有规定外,所有试剂均为分析纯,水为符合GB/T６６８２规定的一级水.５􀆰１　试剂５􀆰１􀆰１　乙酸乙酯(C４H８O２):色谱纯.５􀆰１􀆰２　乙腈(CH３CN):色谱纯.５􀆰１􀆰３　甲醇(CH３OH):色谱纯.５􀆰１􀆰４　正己烷(C６H１４):色谱纯.５􀆰１􀆰５　甲酸(HCOOH):色谱纯.５􀆰１􀆰６　氨水(NH３􀅰H２O).５􀆰１􀆰７　盐酸(HCl).５􀆰２　溶液配制５􀆰２􀆰１　０􀆰１mol/L盐酸溶液:取浓盐酸８􀆰３mL,加水稀释至１L,混匀.５􀆰２􀆰２　２％氨水溶液:取氨水２mL,加水稀释至１００mL,混匀,现用现配.５􀆰２􀆰３　洗脱液:取甲醇８０mL,加水１５mL、氨水５mL,混匀,现用现配.５􀆰２􀆰４　０􀆰１％甲酸水溶液:取水５００mL,加甲酸５００μL,混匀.５􀆰２􀆰５　０􀆰１％甲酸乙腈溶液:取乙腈５００mL,加甲酸５００μL,混匀.５􀆰３　标准品１GB３１６５８􀆰２３—２０２２甲硝唑、地美硝唑、羟基甲硝唑、羟基地美硝唑、甲硝唑ＧD３、地美硝唑ＧD３、羟基甲硝唑ＧD２、羟基地美硝唑ＧD３,含量均≥９５％.具体见附录A.５􀆰４　标准溶液制备５􀆰４􀆰１　标准储备液:取甲硝唑、地美硝唑、羟基甲硝唑、羟基地美硝唑标准品适量(相当于各有效成分１０mg),精密称定,用甲醇溶解并稀释定容于１０mL容量瓶,配制成浓度为１mg/mL的甲硝唑、地美硝唑、羟基甲硝唑和羟基地美硝唑标准储备液.－１８℃以下保存,有效期６个月.５􀆰４􀆰２　内标储备液:取甲硝唑ＧD３、地美硝唑ＧD３、羟基甲硝唑ＧD２和羟基地美硝唑ＧD３标准品适量(相当于各有效成分１０mg),精密称定,用甲醇溶解并稀释定容于１０mL容量瓶,配制成浓度为１mg/mL的甲硝唑ＧD３、地美硝唑ＧD３、羟基甲硝唑ＧD２和羟基地美硝唑ＧD３内标储备液.－１８℃以下保存,有效期６个月.５􀆰４􀆰３　１０μg/mL混合标准工作液:分别精密量取标准储备液各０􀆰１mL于１０mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,配制成浓度为１０μg/mL的混合标准工作液.－１８℃以下保存,有效期６个月.５􀆰４􀆰４　１μg/mL混合标准工作液:精密量取１０μg/mL混合标准工作液１mL于１０mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,配制成浓度为１μg/mL的混合标准工作液.－１８℃以下保存,有效期３个月.５􀆰４􀆰５　０􀆰１μg/mL混合标准工作液:精密量取１μg/mL混合标准工作液１mL于１０mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,配制成浓度为０􀆰１μg/mL的混合标准工作液.－１８℃以下保存,有效期１个月.５􀆰４􀆰６　１０μg/mL混合内标工作液:分别精密量取内标储备液各０􀆰１mL于１０mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,配制成浓度为１０μg/mL的混合内标工作液.－１８℃以下保存,有效期６个月.５􀆰４􀆰７　１μg/mL混合内标工作液:精密量取１０μg/mL内标工作液１mL于１０mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,配制成浓度为１μg/mL的混合内标工作液.－１８℃以下保存,有效期３个月.５􀆰５　材料５􀆰５􀆰１　混合型强阳离子交换反相固相萃取柱:６０mg/３mL,或相当者.５􀆰５􀆰２　微孔滤膜:０􀆰２μm,水相.６　仪器和设备６􀆰１　液相色谱Ｇ串联质谱仪:配电喷雾离子源.６􀆰２　分析天平:感量０􀆰００００１g和０􀆰０１g.６􀆰３　氮吹仪.６􀆰４　涡旋混合器.６􀆰５　离心机.６􀆰６　组织匀浆机.６􀆰７　固相萃取装置.７　试样的制备与保存７􀆰１　试样的制备取适量新鲜或解冻的空白或供试组织,绞碎,并均质.a)　取均质后的供试样品,作为供试试样;b)　取均质后的空白样品,作为空白试样;c)　取均质后的空白样品,添加适宜浓度的标准溶液,作为空白添加试料.７􀆰２　试样的保存－１８℃以下保存.８　测定步骤８􀆰１　提取２GB３１６５８􀆰２３—２０２２称取试样２g(准确至±０􀆰０５g),于５０mL塑料离心管,加１μg/mL混合内标工作液１０μL,涡旋３０s混匀,静置１０min.加乙酸乙酯１５mL,涡旋２min,１００００r/min离心５min.取上清液于另一５０mL离心管中,残渣中加乙酸乙酯１５mL,重复提取一次,合并２次提取液,于２５℃水浴氮气吹干.８􀆰２　净化残余物中加０􀆰１mol/L盐酸溶液５mL,涡旋１min充分溶解,加正己烷５mL,振摇１min,５０００r/min离心５min,弃正己烷层.下层再加正己烷５mL重复除脂一次,弃正己烷层,备用.固相萃取柱依次用甲醇２mL和０􀆰１mol/L盐酸溶液２mL活化,取备用液过柱,依次用０􀆰１mol/L盐酸溶液２mL、甲醇１mL和２％氨水１mL淋洗,用洗脱液２mL洗脱.收集洗脱液,３５℃水浴氮气吹干,残余物中加水０􀆰５mL涡旋１min,滤膜过滤,供液相色谱Ｇ串联质谱测定.８􀆰３　基质匹配标准曲线的制备取经提取和净化的空白试料溶液,加入适量的混合标准工作液和１μg/mL混合内标工作液１０μL,３５℃水浴氮气吹干,加水０􀆰５mL涡旋１min,配制成浓度为２μg/L、４μg/L、２０μg/L、４０μg/L、２００μg/L和４００μg/L的基质匹配标准溶液,过滤后供液相色谱Ｇ串联质谱测定.以测得的硝基咪唑类药物与相应内标的特征离子峰面积之比为纵坐标,标准溶液浓度为横坐标,绘制标准曲线,求回归方程和相关系数.８􀆰４　测定８􀆰４􀆰１　液相色谱参考条件a)　色谱柱:C１８色谱柱(５０mm×２􀆰１mm,１􀆰７μm)或相当者;b)　流动相:A为０􀆰１％的甲酸水溶液,B为０􀆰１％甲酸乙腈溶液,梯度洗脱程序见表１;c)　流速:０􀆰３mL/min;d)　柱温:３０℃;e)　进样量:１０μL.表１　梯度洗脱程序时间,min０􀆰１％甲酸水溶液,％０􀆰１％甲酸乙腈溶液,％０９５５０􀆰５９５５２􀆰０８５１５３􀆰００１００３􀆰１９５５４􀆰５９５５８􀆰４􀆰２　质谱参考条件a)　离子源:电喷雾(ESI)离子源;b)　扫描方式:正离子扫描;c)　检测方式:多反应监测;d)　喷雾电压:３０００V;e)　雾化温度:３５０℃;f)　源温:１００℃;g)　锥孔气流速:３０L/h;h)　雾化气流速:６００L/h;i)　待测药物定性离子对、定量离子对、锥孔电压和碰撞能量的参考值见表２.表２　待测药物定性离子对、定量离子对、锥孔电压和碰撞能量的参考值化合物名称定性离子对m/z定量离子对m/z锥孔电压V碰撞能量eV甲硝唑１７２􀆰１＞８２􀆰１１７２􀆰１＞１２８􀆰２１７２􀆰１＞１２８􀆰２１５２０１５３GB３１６５８􀆰２３—２０２２表２(续)化合物名称定性离子对m/z定量离子对m/z锥孔电压V碰撞能量eV甲硝唑ＧD３１７５􀆰０＞１３１􀆰０１７５􀆰０＞１３１􀆰０１５１５羟基甲硝唑１８８􀆰２＞１２３􀆰２１８８􀆰２＞１２６􀆰２１８８􀆰２＞１２３􀆰２１５１５１５羟基甲硝唑ＧD２１９０􀆰０＞１２５􀆰２１９０􀆰０＞１２５􀆰２１５１５地美硝唑１４２􀆰０＞８１􀆰２１４２􀆰０＞９６􀆰０１４２􀆰０＞９６􀆰０１０２０１５地美硝唑ＧD３１４５􀆰０＞９９􀆰０１４５􀆰０＞９９􀆰０１０１５羟基地美硝唑１５８􀆰０＞５５􀆰２１５８􀆰０＞１４０􀆰３１５８􀆰０＞１４０􀆰３１５１５１０羟基地美硝唑ＧD３１６１􀆰０＞１４３􀆰０１６１􀆰０＞１４３􀆰０１５１０８􀆰４􀆰３　测定法８􀆰４􀆰３􀆰１　定性测定在同样测试条件下,试料溶液中硝基咪唑类药物的保留时间与基质匹配标准工作液中硝基咪唑类药物的保留时间之比,偏差在±２􀆰５％以内,且检测到的相对离子丰度,应当与浓度相当的基质匹配标准溶液离子相对丰度一致.其允许偏差应符合表３要求.表３　定性确证时相对离子丰度的允许偏差单位为百分号相对离子丰度＞５０＞２０~５０＞１０~２０≤１０允许的最大偏差±２０±２５±３０±５０８􀆰４􀆰３􀆰２　定量测定取试料溶液和基质匹配标准工作液,作单点或多点校准,按内标法定量.基质匹配标准工作液及试料溶液中目标物的响应值均应在仪器检测的线性范围内.在上述色谱Ｇ质谱条件下,标准溶液特征离子质量色谱图见附录B.８􀆰５　空白试验取空白试料,除不加药物外,采用完全相同的测定步骤进行平行操作.９　结果计算和表述试样中硝基咪唑类药物的残留量按标准曲线或公式(１)计算.X＝A×A′is×Cs×Cis×VAis×As×C′is×m(１)􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺式中:X———试样中硝基咪唑类药物残留量的数值,单位为微克每千克(μg/kg);A———供试试样溶液中硝基咪唑类药物的峰面积;A′is———基质匹配标准溶液中内标的峰面积;Cs———基质匹配标准溶液中硝基咪唑类药物浓度的数值,单位为微克每升(μg/L);Cis———供试试样中内标浓度的数值,单位为微克每升(μg/L);V———供试试样最终定容体积的数值,单位为毫升(mL);Ais———供试试样溶液中内标的峰面积;As———基质匹配标准溶液中硝基咪唑类药物的峰面积;C′is———基质匹配标准溶液中内标浓度的数值,单位为微克每升(μg/L);m———供试试样质量的数值,单位为克(g).４GB３１６５８􀆰２３—２０２２１０　方法灵敏度、准确度和精密度１０􀆰１　灵敏度本方法的检测限为０􀆰５μg/kg,定量限为１μg/kg.１０􀆰２　准确度本方法在１μg/kg~１０μg/kg添加浓度水平上的回收率为６０％~１２０％.１０􀆰３　精密度本方法批内相对标准偏差≤２０％,批间相对标准偏差≤２０％.５GB３１６５８􀆰２３—２０２２附　录　A(资料性)硝基咪唑类药物中英文通用名称、化学分子式和CAS号硝基咪唑类药物中英文通用名称、化学分子式和CAS号见表A􀆰１.表A􀆰１　硝基咪唑类药物中英文通用名称、化学分子式和CAS号中文通用名称英文通用名称化学分子式CAS号羟基甲硝唑HydroxyMetronidazoleC６H９N３O４４８１２Ｇ４０Ｇ２羟基甲硝唑ＧD２HydroxyMetroni