GB 31613.5-2022 食品安全国家标准 鸡可食组织中抗球虫药物残留量的测定 液相色谱-串联

中华人民共和国国家卫生健康委员会食品安全国家标准鸡可食组织中抗球虫药物残留量的测定液相色谱-串联质谱法22中华人民共和国国家标准备案号：XXXX-XXXXＩＣＳ67.120X31613.5—2022Nationalfoodsafetystandard—Determinationofcoccidiostatsresiduesinchickenedibletissuesbyliquidchromatography-tandemmassspectrometricmethodGB20220920发布－－20230201－－实施发布国家市场监督管理总局中华人民共和国农业农村部CCSGB３１６１３􀆰５—２０２２前　　言本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定起草.本文件系首次发布.ⅠGB３１６１３􀆰５—２０２２食品安全国家标准鸡可食组织中抗球虫药物残留量的测定　液相色谱Ｇ串联质谱法１　范围本文件规定了鸡可食组织中常山酮、氯苯胍、盐霉素、莫能菌素、甲基盐霉素、马度米星铵和拉沙洛西７种抗球虫药物残留量检测的制样和液相色谱Ｇ串联质谱测定方法.本文件适用于鸡肌肉、肝脏和皮脂(皮＋脂)中常山酮、氯苯胍、盐霉素、莫能菌素、甲基盐霉素、马度米星铵和拉沙洛西７种抗球虫药物残留量的检测.２　规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法３　术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义.４　原理试样中残留的抗球虫药物经胰蛋白酶酶解,乙酸乙酯提取,固相萃取柱净化,液相色谱Ｇ串联质谱法检测,基质匹配外标法定量.５　试剂与材料除另有规定外,所有试剂均为分析纯,水为符合GB/T６６８２规定的一级水.５􀆰１　试剂５􀆰１􀆰１　甲醇(CH３OH):色谱纯.５􀆰１􀆰２　乙腈(CH３CN):色谱纯.５􀆰１􀆰３　乙酸(CH３COOH):色谱纯.５􀆰１􀆰４　甲酸(HCOOH):色谱纯.５􀆰１􀆰５　乙酸乙酯(CH３CH２OOCCH３):色谱纯.５􀆰１􀆰６　胰蛋白酶:来源于牛胰腺,≥１００００U/mg.５􀆰１􀆰７　碳酸钠(Na２CO３).５􀆰２　溶液配制５􀆰２􀆰１　１０％碳酸钠溶液:取碳酸钠２０g,加水适量使溶解并稀释至２００mL,混匀.５􀆰２􀆰２　１％乙酸溶液:取乙酸１mL,用水稀释至１００mL,混匀.５􀆰２􀆰３　２０％甲醇溶液:取甲醇２０mL,用水稀释至１００mL,混匀.５􀆰２􀆰４　洗脱液:取甲醇１００mL,加乙酸乙酯２００mL,混匀.５􀆰２􀆰５　复溶液:取甲醇５０mL,加水５０mL、甲酸０􀆰１mL,混匀.５􀆰３　标准品常山酮、氯苯胍、盐霉素、莫能菌素、甲基盐霉素、马度米星铵、拉沙洛西含量≥９５％.具体见附录A.１GB３１６１３􀆰５—２０２２５􀆰４　标准溶液制备５􀆰４􀆰１　标准储备液(１mg/mL):取常山酮、氯苯胍、盐霉素、莫能菌素、甲基盐霉素、马度米星铵、拉沙洛西标准品适量(相当于各有效成分１０mg),精密称定,分别加甲醇适量使溶解并稀释定容于１０mL容量瓶,配制成浓度均为１mg/mL的标准储备液.－１８℃以下避光保存,有效期６个月.５􀆰４􀆰２　混合标准工作液(１０μg/mL):分别精密量取标准储备液各０􀆰１mL,于１０mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,配制成浓度为１０μg/mL的混合标准工作液.－１８℃以下避光保存,有效期６个月.５􀆰４􀆰３　混合标准工作液(１μg/mL):精密量取１０μg/mL的混合标准工作液１mL,于１０mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,配制成浓度为１μg/mL的混合标准工作液.－１８℃以下避光保存,有效期３个月.５􀆰４􀆰４　混合标准工作液(０􀆰１μg/mL):精密量取１μg/mL的混合标准工作液１mL,于１０mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,配制成浓度为０􀆰１μg/mL的混合标准工作液.－１８℃以下避光保存,有效期１个月.５􀆰５　材料５􀆰５􀆰１　三键键合C１８固相萃取柱:５００mg/６mL,或相当者.５􀆰５􀆰２　尼龙微孔滤膜:０􀆰２２μm.６　仪器和设备６􀆰１　液相色谱Ｇ串联质谱仪:配电喷雾离子源.６􀆰２　分析天平:感量０􀆰０１g和０􀆰００００１g.６􀆰３　高速冷冻离心机:１００００r/min.６􀆰４　组织匀浆机.６􀆰５　涡旋混合器.６􀆰６　固相萃取装置.６􀆰７　氮吹仪.６􀆰８　水浴摇床.６􀆰９　pH计.７　试样的制备与保存７􀆰１　试样的制备取适量新鲜或解冻的空白或供试组织,绞碎并均质.a)　取均质后的供试样品,作为供试试样;b)　取均质后的空白样品,作为空白试样;c)　取均质后的空白样品,添加适宜浓度的标准工作液,作为空白添加试样.７􀆰２　试样的保存－１８℃以下保存.８　测定步骤８􀆰１　提取称取试料１g(准确至±０􀆰０１g),加胰蛋白酶２５mg、水５mL,涡旋１min,用１０％碳酸钠溶液调pH至７􀆰５,４０℃水浴过夜酶解.取出放至室温,加１０％碳酸钠溶液１mL,涡旋１min.加乙酸乙酯９mL,涡旋５min,于４℃、１００００r/min离心１０min,转移上清液,残渣重复提取１次.合并２次提取液,用乙酸乙酯稀释至２０􀆰０mL,混匀.取提取液２􀆰０mL于３５℃水浴氮气吹干,加乙腈１mL涡旋１min,加水１０mL,混匀,备用.８􀆰２　净化固相萃取柱依次用甲醇５mL、１％乙酸溶液５mL活化,取备用液全部过柱,控制流速为每２s~３s２GB３１６１３􀆰５—２０２２１滴.用１％乙酸溶液３mL和２０％甲醇溶液３mL淋洗,用洗脱液１０mL洗脱.收集洗脱液,３５℃水浴氮气吹干,加复溶液１􀆰０mL涡旋１min,于－４℃、１００００r/min离心１０min,取上清液,过滤膜后供液相色谱Ｇ串联质谱测定.８􀆰３　基质匹配标准曲线的制备取６份空白样品经提取和净化后,加入适量的标准工作液,３５℃水浴氮气吹干,加复溶液１􀆰０mL涡旋１min,配制成浓度为０􀆰５μg/L、１μg/L、５μg/L、１０μg/L、２５μg/L和５０μg/L的基质匹配标准溶液,于－４℃、１００００r/min离心１０min,取上清液,过滤膜后供液相色谱Ｇ串联质谱测定.以测得特征离子峰面积为纵坐标、对应的标准溶液浓度为横坐标,绘制标准曲线,求回归方程和相关系数.８􀆰４　测定８􀆰４􀆰１　液相色谱参考条件色谱柱:C１８(５０mm×２􀆰１mm,１􀆰７μm),或相当者;流动相:A为０􀆰１％甲酸水溶液,B为０􀆰１％甲酸甲醇溶液;梯度洗脱:梯度洗脱程序见表１;流速:０􀆰３mL/min;柱温:３０℃;进样量:１０μL.表１　梯度洗脱程序时间,minA,％B,％０９０１００􀆰５９０１０１􀆰００１００２􀆰００１００２􀆰１９０１０４􀆰０９０１０８􀆰４􀆰２　质谱参考条件a)　离子源:电喷雾(ESI)离子源;b)　扫描方式:正离子扫描;c)　检测方式:多反应监测;d)　电离电压:４􀆰０kV;e)　离子源温度:１００℃;f)　雾化温度:３５０℃;g)　锥孔气流速:３０L/h;h)　雾化气流速:６００L/h;i)　待测药物的定性离子对、定量离子对、锥孔电压和碰撞能量的参考值见表２.表２　待测药物的定性离子对、定量离子对、锥孔电压和碰撞能量的参考值药物定性离子对m/z定量离子对m/z锥孔电压V碰撞能量eV常山酮４１６􀆰０＞１００􀆰２４１６􀆰０＞１２０􀆰２４１６＞１２０􀆰２２５２０２０氯苯胍３３４􀆰２＞１３８􀆰１３３４􀆰２＞１５５􀆰１３３４􀆰２＞１５５􀆰１３５３０２０盐霉素７７３􀆰５＞２６５􀆰２７７３􀆰５＞５３１􀆰４７７３􀆰５＞２６５􀆰２５５４０５５莫能菌素６９３􀆰５＞４６１􀆰４６９３􀆰５＞４７９􀆰４６９３􀆰５＞４６１􀆰４５５５０５０３GB３１６１３􀆰５—２０２２表２(续)药物定性离子对m/z定量离子对m/z锥孔电压V碰撞能量eV甲基盐霉素７８７􀆰７＞４３１􀆰５７８７􀆰７＞５３１􀆰５７８７􀆰６＞４３１􀆰５６０５０４０马度米星铵９３９􀆰２＞８５９􀆰５９３９􀆰２＞８７７􀆰５９３９􀆰５＞８７７􀆰５４５５０３０拉沙洛西６１３􀆰４＞３７７􀆰４６１３􀆰４＞５７７􀆰５６１３􀆰４＞３７７􀆰４４５３５３５８􀆰４􀆰３　测定法８􀆰４􀆰３􀆰１　定性测定在同样测试条件下,试料溶液中抗球虫药物的保留时间与基质匹配标准工作液中抗球虫药物的保留时间之比,偏差在±２􀆰５％以内,且检测到的相对离子丰度,应当与浓度相当的基质匹配标准溶液相对离子丰度一致.其允许偏差应符合表３的要求.表３　定性确证时相对离子丰度的允许偏差单位为百分号相对离子丰度＞５０＞２０~５０＞１０~２０≤１０允许的最大偏差±２０±２５±３０±５０８􀆰４􀆰３􀆰２　定量测定取试料溶液和基质匹配标准工作液,作单点或多点校准,按外标法定量.基质匹配标准工作液及试料溶液中目标物的响应值均应在仪器检测的线性范围内.在上述色谱Ｇ质谱条件下,标准溶液特征离子质量色谱图见附录B.８􀆰５　空白试验取空白试料,除不加药物外,采用完全相同的测定步骤进行平行操作.９　结果计算和表述试样中抗球虫药物的残留量按标准曲线或公式(１)计算.X＝A×Cs×V１×V３As×V２×m(１)􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺式中:X———试样中抗球虫药物残留量的数值,单位为微克每千克(μg/kg);A———试样中抗球虫药物的峰面积;Cs———基质匹配标准溶液中抗球虫药物浓度的数值,单位为微克每升(μg/L);V１———提取液体积的数值,单位为毫升(mL);V２———分取提取液体积的数值,单位为毫升(mL);V３———复溶液体积的数值,单位为毫升(mL);As———基质匹配标准溶液中抗球虫药物的峰面积;m———试样质量的数值,单位为克(g).１０　方法灵敏度、准确度和精密度１０􀆰１　灵敏度本方法的检测限为５μg/kg,定量限为１０μg/kg.１０􀆰２　准确度本方法在１０μg/kg~１００μg/kg添加浓度水平上的回收率为６０％~１２０％.４GB３１６１３􀆰５—２０２２１０􀆰３　精密度本方法的批内相对标准偏差≤２０％,批间相对标准偏差≤２０％.５GB３１６１３􀆰５—２０２２附　录　A(资料性)抗球虫药物中英文通用名称、化学分子式和CAS号抗球虫药物中英文通用名称、化学分子式和CAS号见表A􀆰１.表A􀆰１　抗球虫药物中英文通用名称、化学分子式和CAS号中文通用名称英文通用名称化学分子式CAS号常山酮HalofuginoneC１６H１７BrClN３O３５５８３７Ｇ２０Ｇ２氯苯胍RobenidineC１５H１３Cl２N５２５８７５Ｇ５１Ｇ８盐霉素SalinomycinC４２H７０O１１５３００３Ｇ１０Ｇ４莫能菌素MonensinC３６H６２O１１１７０９０Ｇ７９Ｇ８甲基盐霉素ANarasinAC４３H７２O１１５５１３４Ｇ１３Ｇ９马度米星铵MaduramicinAmmoniumC４７H８３NO１７８４８７８Ｇ６１Ｇ５拉沙洛西LasalocidC３４H５４O８２５９９９Ｇ３１Ｇ９６GB３１６１３􀆰５—２０２２附　录　B(资料性)抗球虫药物标准溶液特征离子质量色谱图抗球虫药物标准溶液特征离子质量色谱图见图B􀆰１.图B􀆰１　抗球虫药物标准溶液特征离子质量色谱图(１μg/L)７