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中华人民共和国国家卫生健康委员会食品安全国家标准禽蛋、奶和奶粉中多西环素残留量的测定液相色谱-串联质谱法04中华人民共和国国家标准备案号：XXXX-XXXXＩＣＳ67.050X31659.2—2022Nationalfoodsafetystandard—Determinationofdoxycyclineresidueineggs,milkandmilkpowderbyliquidchromatography-tandemmassspectrometrymethodGB2022 09 20发布－－2023 02 01－－实施发布国家市场监督管理总局中华人民共和国农业农村部CCSGB３１６５９２—２０２２前 言本文件按照GB/T１１—２０２０«标准化工作导则 第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定起草.本文件系首次发布.ⅠGB３１６５９２—２０２２食品安全国家标准禽蛋、奶和奶粉中多西环素残留量的测定 液相色谱Ｇ串联质谱法１ 范围本文件规定了禽蛋、奶和奶粉中多西环素残留量检测的制样和液相色谱Ｇ串联质谱测定方法.本文件适用于鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋、牛奶粉、羊奶粉、牛奶和羊奶中多西环素残留量的测定.２ 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.GB/T６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法３ 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义.４ 原理试样中残留的多西环素,经McllvaineＧNa２EDTA缓冲液提取,HLB柱净化,液相色谱Ｇ串联质谱法测定,外标法定量.５ 试剂和材料５１ 试剂除另有规定外,所有试剂均为分析纯,水为符合GB/T６６８２规定的一级水.５１１ 甲醇(CH３OH):色谱纯.５１２ 乙腈(CH３CN):色谱纯.５１３ 甲酸(HCOOH):色谱纯.５１４ 一水柠檬酸(C６H８O７H２O).５１５ 十二水磷酸氢二钠(Na２HPO４１２H２O).５１６ 二水乙二胺四乙酸二钠(C１０H１４N２Na２O８２H２O).５１７ 氢氧化钠(NaOH).５２ 溶液配制５２１ 氢氧化钠溶液(１mol/L):取氢氧化钠４g,加水溶解并稀释至１００mL,混匀.５２２ McllvaineＧNa２EDTA缓冲液:取一水柠檬酸１２９g、十二水磷酸氢二钠２７６g、二水乙二胺四乙酸二钠３７２g,加水９００mL使溶解,用氢氧化钠溶液调pH至４０±０５,加水稀释至１０００mL,混匀.５２３ ０１％甲酸溶液:取甲酸５００μL,用水稀释至５００mL,混匀.５２４ ５％甲醇溶液:取甲醇５mL,用水稀释至１００mL,混匀.５２５ ３０％甲醇溶液:取甲醇３０mL,用水稀释至１００mL,混匀.５３ 标准品盐酸多西环素(doxycyclinehydrochloride,C２２H２４N２O８HCl,CAS号:１０５９２Ｇ１３Ｇ９),含量≥９８７％.１GB３１６５９２—２０２２５４ 标准溶液制备５４１ 标准储备液:取盐酸多西环素适量(相当于多西环素１０mg),精密称定,加甲醇适量使溶解并定容至１０mL容量瓶,配制成浓度为１mg/mL的标准储备液.－１８℃以下保存,有效期１个月.５４２ 标准中间液Ⅰ:准确量取标准储备液０１mL,于１０mL容量瓶,用３０％甲醇稀释至刻度,混匀,配制成浓度为１０μg/mL的标准中间液Ⅰ.现用现配.５４３ 标准中间液Ⅱ:准确量取中间液Ⅰ１０mL,于１０mL容量瓶中,用３０％甲醇稀释至刻度,混匀,配制成浓度为１０００ng/mL的标准中间液Ⅱ.现用现配.５４４ 系列标准工作液:分别准确量取标准中间液Ⅱ０１mL、０２mL、０５mL、１０mL、２０mL于１０mL容量瓶中,用３０％甲醇稀释至刻度,混匀,配制成浓度分别为１０ng/mL、２０ng/mL、５０ng/mL、１００ng/mL、２００ng/mL的系列标准工作液.现用现配.５５ 材料５５１ 固相萃取柱:亲水亲脂平衡型固相萃取柱６０mg/３mL.５５２ 微孔尼龙滤膜:０２２μm.５５３ 定性快速滤纸.６ 仪器和设备６１ 液相色谱Ｇ串联质谱仪:配电喷雾离子源(ESI).６２ 分析天平:感量０００００１g和００１g.６３ 涡旋混合器.６４ 涡旋振荡器.６５ 高速冷冻离心机:转速可达１４０００r/min.６６ 固相萃取装置.６７ 氮吹仪.７ 试样的制备与保存７１ 试样的制备取适量新鲜的空白或供试禽蛋,去壳并均质.取适量新鲜或解冻的空白或供试奶,混合均匀.取适量新鲜的空白或供试奶粉,混合均匀.a) 取均质的供试样品,作为供试试样;b) 取均质的空白样品,作为空白试样;c) 取均质的空白样品,添加适宜浓度的标准溶液,作为空白添加试样.７２ 试样的保存禽蛋、奶－１８℃以下保存,奶粉常温避光保存.８ 测定步骤８１ 提取禽蛋、奶:取试料２g(准确至±００５g),于５０mL聚丙烯离心管中,加入McllvaineＧNa２EDTA缓冲液８mL,振荡１０min,４℃下１４０００r/min离心１０min,吸取上层液体于另一５０mL离心管中.用McllvaineＧNa２EDTA缓冲液重复提取２次,每次８mL,合并提取液,４℃下１４０００r/min离心１０min,取上清液备用(奶试样上清液经滤纸过滤后备用).奶粉:取试料２g(准确至±００５g),于５０mL聚丙烯离心管中,加入McllvaineＧNa２EDTA缓冲液１０mL,振荡１０min,４℃下１４０００r/min离心１０min,吸取上清液于另一５０mL离心管.用McllvaineＧ２GB３１６５９２—２０２２Na２EDTA缓冲液重复提取２次,每次１０mL,合并提取液,４℃下１４０００r/min离心１０min,上清液过滤纸后备用.８２ 净化取固相萃取柱,依次用甲醇、水各３mL活化.取备用液,过柱,用水３mL,５％甲醇３mL淋洗,抽干,加甲醇３mL洗脱,抽干,收集洗脱液,于４０℃下氮气吹至液体小于１mL,加３０％甲醇至１０mL,涡旋混匀,过微孔尼龙滤膜,供液相色谱Ｇ串联质谱仪测定.８３ 基质匹配标准曲线的制备准确移取系列标准工作液各１００μL于经８１~８２步骤处理所得空白洗脱液中,４０℃下氮气吹至液体小于１mL,加３０％甲醇至１０mL,涡旋混匀,配制成浓度为１０ng/mL、２０ng/mL、５０ng/mL、１００ng/mL、２００ng/mL的系列基质匹配标准溶液,过微孔尼龙滤膜,供液相色谱Ｇ串联质谱仪测定.以多西环素特征离子质量色谱峰面积为纵坐标、标准溶液浓度为横坐标,绘制基质匹配标准曲线.８４ 测定８４１ 液相色谱参考条件a) 色谱柱:C１８柱,柱长１００mm,内径２１mm,粒径１７μm,或相当者;b) 流动相:A为乙腈,B为０１％甲酸溶液;c) 流速:０３mL/min;d) 进样量:１０μL;e) 柱温:３０℃;f) 流动相梯度洗脱程序见表１.表１ 梯度洗脱程序时间minA％B％００１０９０４０４０６０４１１０９０５０１０９０８４２ 质谱参考条件a) 离子源:电喷雾离子源;b) 扫描方式:正离子扫描;c) 检测方式:多反应离子监测(MRM);d) 离子源温度:１５０℃;e) 脱溶剂温度:４５０℃;f) 毛细管电压:３３kV;g) 定性离子对、定量离子对及锥孔电压和碰撞能量见表２.表２ 多西环素药物的质谱参数被测物名称定性离子对m/z定量离子对m/z锥孔电压V碰撞能量eV多西环素４４５２＞３２１０４４５２＞１５４０４４５２＞１５４０３４２８０２８０８４３ 测定法８４３１ 定性测定在同样测试条件下,试料溶液中多西环素的保留时间与基质匹配标准工作液中多西环素的保留时间相对偏差在±２５％以内,且检测到的离子的相对丰度,应当与浓度相当的基质匹配标准溶液相对丰度一致.其允许偏差应符合表３的要求.３GB３１６５９２—２０２２表３ 定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差单位为百分号相对离子丰度允许偏差＞５０±２０＞２０~５０±２５＞１０~２０±３０≤１０±５０８４３２ 定量测定取试料溶液和基质匹配标准工作液,作单点或多点校准,按外标法以峰面积定量,基质匹配标准工作液及试料溶液中的多西环素响应值均应在仪器检测的线性范围内.在上述色谱Ｇ质谱条件下,空白鸡蛋基质匹配标准溶液特征离子质量色谱图见附录A.８５ 空白试验取空白试料,除不加药物外,采用完全相同的测定步骤进行测定.９ 结果计算和表述试样中多西环素的残留量按标准曲线或公式(１)计算.X＝Cs×Ai×VAs×m(１)式中:X———试样中多西环素残留量的数值,单位为微克每千克(μg/kg);Cs———基质匹配标准溶液中多西环素浓度的数值,单位为纳克每毫升(ng/mL);Ai———试样溶液中多西环素峰面积;V———溶解残余物所用溶液体积的数值,单位为毫升(mL);As———基质匹配标准溶液中多西环素峰面积;m———试样质量的数值,单位为克(g).１０ 检测方法的灵敏度、准确度和精密度１０１ 灵敏度本方法的检测限为１μg/kg,定量限为２μg/kg.１０２ 准确度 本方法在２μg/kg~１０μg/kg添加浓度水平上的回收率为６０％~１２０％.１０３ 精密度本方法的批内相对标准偏差≤２０％,批间相对标准偏差≤２０％.４GB３１６５９２—２０２２附 录 A(资料性)鸡蛋基质匹配标准溶液特征离子质量色谱图鸡蛋基质匹配标准溶液特征离子质量色谱图A１.图A１ 鸡蛋基质匹配标准溶液特征离子质量色谱图(４μg/L)５