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书书书犐犆犛０７．０８０犃４０!#$%&’’()*犌犅／犜３８１６３—２０１９!#$%&’()*+,-./0-1犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犪犾犾犲狉犵犲狀犻犮狆狉狅狋犲犻狀—犔犆犕犛／犕犛犿犲狋犺狅犱２０１９１０１８23２０１９１０１８45’(+,-./012!’’()*3/045623书书书前 言 本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由全国生化检测标准化技术委员会（ＳＡＣ／ＴＣ３８７）提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心、辽宁出入境检验检疫局检验检疫技术中心。本标准主要起草人：陈颖、古淑青、邓晓军、张九凯、郑秋月、王娉、黄文胜、韩建勋。Ⅰ犌犅／犜３８１６３—２０１９常见过敏蛋白的测定液相色谱串联质谱法１ 范围本标准规定了固态食品中牛奶、鸡蛋、大豆、花生、榛子、杏仁和核桃过敏蛋白的液相色谱串联质谱检测方法。本标准适用于含小麦粉、燕麦粉、腰果、可可粉等固态食品基质中牛奶、鸡蛋、大豆、花生、榛子、杏仁和核桃过敏蛋白的液相色谱串联质谱测定和确证。２ 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法３ 术语和定义、缩略语３．１ 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１．１特征肽 犮犺犪狉犪犮狋犲狉犻狊狋犻犮狆犲狆狋犻犱犲唯一在靶蛋白的胰蛋白酶消化产物中发现、其氨基酸序列具有专属性的多肽。３．１．２食物过敏 犳狅狅犱犪犾犾犲狉犵狔免疫机制介导的食物免疫反应不良反应，即食物蛋白引起的异常或过强的免疫反应。 注：免疫反应可由ＩｇＥ或非ＩｇＥ介导。表现为一疾病群，症状累及皮肤、呼吸、消化、心血管等系统。３．１．３过敏原 犪犾犾犲狉犵犲狀能够引起机体免疫系统异常反应的成分。３．１．４过敏蛋白 犪犾犾犲狉犵犲狀狆狉狅狋犲犻狀能够引起机体免疫系统异常反应的成分中的蛋白质。３．１．５肽 狆犲狆狋犻犱犲两个或两个以上的氨基酸脱水缩合形成的有机化合物。３．１．６胰蛋白酶 狋狉狔狆狊犻狀从动物胰脏提取的一种丝氨酸蛋白水解酶，能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断，特１犌犅／犜３８１６３—２０１９异性较强。３．２ 缩略语下列缩略语适用于本文件。ＤＴＴ：二硫苏糖醇（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）ＩＡＡ：碘代乙酰胺（ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｅ）ＬＣＭＳ／ＭＳ：液相色谱串联质谱法（ｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｔａｎｄｅｍｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）ＭＲＭ：多反应监测（ｍｕｌｔｉｐｌｅｒｅａｃｔｉｏｎｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）Ｔｒｉｓ：三羟甲基氨基甲烷［ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ］４ 原理利用质谱技术结合蛋白质组学软件挖掘能够鉴别区分目标食品过敏原特征肽段。通过构建的特征肽段的质谱信息，对被测样品蛋白酶解后的多肽混合物进行定向监测，实现对食品过敏原的定性检测。质谱中特征肽段的响应峰面积与过敏原的含量呈线性关系，将质谱响应峰面积与过敏原含量建立标准曲线，以肽段的谱峰面积代表过敏原的实际量，通过标准曲线计算得到被测食品过敏原含量。５ 主要试剂除非有特殊说明，仅使用分析纯试剂和符合ＧＢ／Ｔ６６８２规定的一级水。５．１ 碳酸氢铵（ＮＨ４ＨＣＯ３）。５．２ 二硫苏糖醇（Ｃ４Ｈ１０Ｏ２Ｓ２，ＤＴＴ）。５．３ 碘代乙酰胺（ＩＣＨ２ＣＯＮＨ２，ＩＡＡ）。５．４ 三羟甲基氨基甲烷（Ｃ４Ｈ１１ＮＯ３，Ｔｒｉｓ）。５．５ 盐酸。５．６ 磷酸。５．７ 乙酸（ＣＨ３ＣＯＯＨ）：色谱纯。５．８ 甲酸（ＨＣＯＯＨ）：色谱纯。５．９ 乙腈（ＣＨ３ＣＮ）：色谱纯。５．１０ 碳酸氢铵溶液（５００ｍｍｏｌ／Ｌ）：称取３．９５ｇ碳酸氢铵，用水溶解后定容至１００ｍＬ。５．１１ 碳酸氢铵溶液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ）：称取３．９５ｇ碳酸氢铵，用水溶解后定容至１０００ｍＬ。５．１２ 二硫苏糖醇（５００ｍｍｏｌ／Ｌ）：称取０．７７１ｇ二硫苏糖醇，用５００ｍｍｏｌ／Ｌ碳酸氢铵溶液溶解后定容至１０ｍＬ。４℃冷藏可保存一个月。５．１３ 碘代乙酰胺溶液（５００ｍｍｏｌ／Ｌ）：称取０．９２５ｇ碘代乙酰胺，用５００ｍｍｏｌ／Ｌ碳酸氢铵溶液溶解后定容至１０ｍＬ。４℃避光冷藏保存一个月。５．１４ ＴｒｉｓＨＣｌ溶液（４０ｍｍｏｌ／Ｌ）：称取２．４２ｇＴｒｉｓ，溶解于８００ｍＬ水中，用１０％盐酸调节ｐＨ至８．０±０．１，用水定容至１０００ｍＬ。５．１５ 考马斯亮蓝试剂：称取１００ｍｇ考马斯亮蓝Ｇ２５０溶于５０ｍＬ９５％乙醇，加入１００ｍＬ８５％的磷酸，用蒸馏水补充至２００ｍＬ。５．１６ 甲酸的水溶液（０．１％，体积分数）：准确移取１．０ｍＬ甲酸，用水定容至１０００ｍＬ。５．１７ 甲酸的乙腈溶液（０．１％，体积分数）：准确移取１．０ｍＬ甲酸，用乙腈定容至１０００ｍＬ。５．１８ 胰蛋白酶溶液：１００μｇ胰蛋白酶（活力大于４０００Ｕ／ｍｇ蛋白质），用１００μＬ１％乙酸溶液溶解。溶液于－２０℃可保存６个月。２犌犅／犜３８１６３—２０１９６ 主要仪器设备６．１ 液相色谱串联质谱仪：配有电喷雾离子（ＥＳＩ）源的三重四级杆质谱仪。６．２ 分析天平：感量为０．０１ｇ、０．００１ｇ、０．１ｇ。６．３ 恒温水浴锅。６．４ 离心机：转速不低于２６８３犵。６．５ 超滤离心管（１０ｋＤ截止膜）。６．６ 注射器和０．２２μｍ水系滤膜（聚醚砜滤膜）。６．７ 涡旋混匀仪。６．８ ｐＨ计：测量精度为０．０１。６．９ 微量移液器：０．５μＬ～１０μＬ，１０μＬ～１００μＬ，２０μＬ～２００μＬ，２００μＬ～１０００μＬ。６．１０ 组织研磨器。６．１１ 具塞离心管。６．１２ 旋转蒸发仪。６．１３ 分光光度计。７．１ 试样制备７．１ 标准工作液制备７．１．１ 过敏原标准品：榛子、核桃、杏仁、大豆、花生、全脂奶粉和全蛋粉，或等效商业化标准品。７．１．２ 食品基质标准品：小麦粉（饼干基质）、腰果（坚果基质）、燕麦粉（早餐谷物基质）、可可粉（巧克力基质）（以上基质均无７．１．１中提到的７种过敏原），或等效商业化标准品。７．１．３ 样品制备：称取每种过敏原标准品和食品基质标准品５００ｇ±０．１ｇ，采用粉碎机粉碎后，再将其研磨成细粉状，过５０目筛，装入洁净盛样容器内，密封并标明标记，备用。７．１．４ 标准储备液：分别准确称取１ｇ（±０．００５ｇ）（精确至０．００１ｇ）过敏原标准品和食品基质（７种过敏原分别配制４种基质），充分混匀后加入ＴｒｉｓＨＣｌ溶液，定容至２０ｍＬ。震荡均匀使试样完全溶解，置于水浴锅６０℃加热振荡提取３ｈ。提取液以１３８００犵高速离心５ｍｉｎ，上清液过低蛋白质吸附的０．２２μｍ聚醚砜滤膜后，用Ｂｒａｄｆｏｒｄ方法（考马斯亮蓝法）测定提取液中总蛋白的浓度，总蛋白浓度在０．０５ｇ／ｍＬ以上视为有效提取，储备液置于－２０℃冰箱内保存备用。７．１．５ 系列标准溶液：准确移取适量的标准储备液，用含不同基质的ＴｒｉｓＨＣｌ溶液配制成最终浓度为含全脂奶粉总蛋白０．２５ｍｇ／Ｌ、０．５ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ、２ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ（相当于过敏原质量分数２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇ），花生、榛子、杏仁、大豆、鸡蛋、核桃总蛋白０．５ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ、２ｍｇ／Ｌ、４ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ、８０ｍｇ／Ｌ、１６０ｍｇ／Ｌ（相当于过敏原质量分数５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、８００ｍｇ／ｋｇ、１６００ｍｇ／ｋｇ）的系列标准工作溶液。７．２ 试样保存试样与蛋白提取液均在－２０℃冰箱保存。在制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。３犌犅／犜３８１６３—２０１９８ 分析步骤８．１ 蛋白提取与纯化称取混合均匀的试样约２ｇ（±０．００５ｇ）（精确至０．００１ｇ），于５０ｍＬ具塞塑料离心管中，加入２０ｍＬＴｒｉｓＨＣｌ溶液，振荡均匀使试样完全溶解，置于水浴锅６０℃加热振荡提取３ｈ。提取液以１３８００犵高速离心５ｍｉｎ，取上清液过低蛋白质吸附的０．２２μｍ聚醚砜滤膜，用Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（考马斯亮蓝法）测定提取液中总蛋白的浓度。准确移取上述蛋白粗提液２００μＬ加入超滤离心管（１０ｋＤ）中，以１３８００犵高速离心１５ｍｉｎ，超滤去除小分子杂质；向超滤离心管中加入１００μＬ５００ｍｍｏｌ／Ｌ的碳酸氢铵，润洗超滤膜，以１３８００犵高速离心１５ｍｉｎ至膜上完全无液体残留，重复３次。准确移取２００μＬ５００ｍｍｏｌ／Ｌ碳酸氢铵溶液复溶膜上的截留蛋白，涡旋超滤离心管。８．２ 烷基化与酶解移取１５０μＬ５００ｍｍｏｌ／Ｌ碳酸氢铵溶液、１０μＬ二硫苏糖醇溶液加入上述超滤管样品溶液中，混匀后置７５℃下恒温水浴３０ｍｉｎ；冷却至室温，加入３０μＬ碘代乙酰胺溶液，暗处静置３０ｍｉｎ。１３８００犵高速离心３０ｍｉｎ至膜上干燥无液体残留。移取５０ｍｍｏｌ／Ｌ的碳酸氢铵溶液２００μＬ至超滤离心膜上，涡旋后１３８００犵高速离心１５ｍｉｎ，超滤去除反应剩余碘代乙酰胺等杂质，离心至膜上无液体残留，弃掉收集管中的废液，并加入超纯水清洗。在超滤膜上加入１００μＬ５０ｍｍｏｌ／Ｌ的碳酸氢铵溶液，并加入４μＬ胰蛋白酶乙酸溶液，充分混匀后置于３７℃恒温水浴中酶解４ｈ。将超滤管进行１３８００犵高速离心３０ｍｉｎ，至膜上干燥无液体残留，加入１００μＬ５０ｍｍｏｌ／Ｌ的碳酸氢铵溶液，涡旋后１３８００犵高速离心１５ｍｉｎ，重复３次。合并收集管中的膜上酶切肽段，放入真空旋转蒸发仪中离心旋干。准确移取流动相Ａ甲酸水溶液（０．１％，体积分数）１００μＬ复溶干燥后的肽段，涡旋后１３８００犵高速离心１５ｍｉｎ。移取上清液１００μＬ于进样瓶中，供液相色谱串联质谱仪检测。８．３ 仪器参考条件８．３．１ 液相色谱条件：ａ） 色谱柱：Ｃ１８柱，１５０ｍｍ×４．６ｍｍ（内径），填料粒径３．５μｍ，孔径３０ｎｍ（３００?）或性能相当者；ｂ） 柱温：４０℃；ｃ） 流动相：Ａ：体积分数为０．１％的甲酸水溶液，Ｂ：体积分数为０．１％的甲酸乙腈溶液，梯度洗脱见表１；ｄ） 流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ；ｅ）进样量：１０μＬ。表１ 梯度洗脱程序时间／ｍｉｎ流动相Ａ／％流动相Ｂ／％０．００９７．０３．０１．００９７．０３．０１０．００７０．０３０．０４犌犅／犜３８１６３—２０１９表１（续）时间／ｍｉｎ流动相Ａ／％流动相Ｂ／％１３．００４５．０５５．０１３．１０２０．０８０．０１６．００２０．０８０．０１６．１０９７．０３．０２０．００９７．０３．０８．３．２ 质谱条件（不同品牌、型号质谱仪可做相应调整）：ａ） 电离方式：电喷雾电离，正离子；ｂ） 扫描方式：多反应监测（ＭＲＭＳｃｈｅｄｕｌｅｄ）；ｃ） 雾化气、气帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气及其他合适气体；使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求，参考质谱条件参见附录Ａ中表Ａ．１；ｄ）电喷雾电压：４５００Ｖ；ｅ） 离子源温度：５００℃；ｆ） 雾化器压力：０．４４８ＭＰａ（６５ｐｓｉ）；ｇ） 气帘气压力：０．２４１ＭＰａ（３５ｐｓｉ）。８．４ 空白试验样品前处理时，除不加试样外，均按以上操作步骤进行。８．５ 定性测定在相同使用条件下，按照液相色谱串联质谱条件测定全脂奶粉、花生、榛子、杏仁、大豆、鸡蛋、核桃的标准工作溶液，同时测定样品溶液。定性时样品中待测物质的保留时间，与基质标准溶液的保留时间偏差在±２．５％之内；且样品中所选择的肽段定性离子均出现（附录Ａ中表Ａ．１），各组分定性离子的相对丰度与标准工作溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表２规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表２ 液相色谱串联质谱法定性离子相对丰度的最大允许偏差相对丰度／％＞