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ICS67.180.10CCSX31中华人民共和国供销合作行业标准GH/T1316—2020GH蜂蜜中松二糖、松三糖、吡喃葡糖基蔗糖、异麦芽糖和蜜三糖含量的测定高效液相色谱法DeterminationofTuranose,Melezitose,Erlose,IsomaltoseandRaffinoseinHoney—Highperformanceliquidchromatographymethod2020-12-07发布2021-03-01实施中华全国供销合作总社发布GH/T1316—20201前言本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由中华全国供销合作总社提出。本文件由全国蜂产品标准化工作组（SAC/SWG2）归口。本文件起草单位：秦皇岛海关技术中心、中国检验检疫科学研究院、上海冠生园蜂制品有限公司。本标准主要起草人：崔宗岩、常巧英、黄学者、贾光群、刘晓茂、贾英杰、李亮、曹彦忠、李学民、张进杰。GH/T1316—20202蜂蜜中松二糖、松三糖、吡喃葡糖基蔗糖、异麦芽糖和蜜三糖含量的测定高效液相色谱法1范围本文件规定了蜂蜜中松二糖、松三糖、吡喃葡糖基蔗糖、异麦芽糖和蜜三糖含量的高效液相色谱测定方法。本文件适用于蜂蜜中松二糖、松三糖、吡喃葡糖基蔗糖、异麦芽糖和蜜三糖含量的测定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4原理试样用水溶解，乙腈定容后，过滤，液相色谱-蒸发光散射法测定，外标法定量。5试剂和材料5.1乙腈：色谱纯。5.2水：GB/T6682规定的一级水。5.3三乙胺：优级纯。5.4乙腈+水溶液（40：60，v/v）：准确量取40mL乙腈（5.1）置于100mL容量瓶中，用水（5.2）定容，摇匀。5.5松二糖、松三糖、吡喃葡糖基蔗糖、异麦芽糖和蜜三糖标准物质：信息见附录A，纯度均≥98%。5.6标准储备溶液：称取松二糖、松三糖、吡喃葡糖基蔗糖、异麦芽糖和蜜三糖标准物质（5.5）各0.2g（精确至0.1mg），分别置于10mL容量瓶中，加入6mL水溶解，用乙腈定容，摇匀，配置成各标准物质储备液，浓度为2g/100mL。该储备液储存在4℃条件下，有效期3个月。5.7标准工作溶液：分别吸取松二糖、松三糖、吡喃葡糖基蔗糖、异麦芽糖和蜜三糖标准储备溶液（5.6）50μL、100μL、250μL、500μL、750μL至10mL容量瓶中，用乙腈+水溶液（5.4）稀释并定容，混匀，分别配制成0.01g/100mL、0.02g/100mL、0.05g/100mL、0.1g/100mL、0.15g/100mL浓度的5种糖混合标准工作溶液，用于绘制标准工作曲线。该工作溶液现用现配。GH/T1316—202036仪器和设备6.1高效液相色谱仪：配有蒸发光散射检测器。6.2分析天平：感量0.1mg和0.001g。6.3微量可调移液器：量程100µL和1mL。6.4有机相过滤膜：0.22µm。6.5样品瓶：2mL。6.6容量瓶：10mL，100mL。7试样制备与保存7.1试样的制备对无结晶的实验样品，将其搅拌均匀。对有结晶的样品，在密闭情况下，置于不超过60℃的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，冷却至室温。分出0.5kg作为试样。制备好的试样置于样品瓶中，密封，并做上标记。7.2试样的保存将试样于常温下保存。8测定步骤8.1样品前处理用天平（6.2）称取5g试样（精确至0.001g），置于100mL烧杯中，加入30mL水，用玻璃棒搅拌使试样完全溶解，转移至100mL容量瓶（6.6）中，再用10mL水洗烧杯并转移至上述100mL容量瓶中，重复3次，然后用乙腈定容，混匀。用0.22μm滤膜（6.4）将样液过滤入样品瓶（6.5）中，供高效液相色谱仪（6.1）测定。8.2测定8.2.1液相色谱参考条件液相色谱参考条件如下：a)色谱柱：Amide1.7μm150mm×2.1mmi.d（或相似规格）；b)流动相：A，0.1%三乙胺（5.3）-乙腈溶液；B，水。梯度洗脱条件见表1；c)流速：0.25mL/min；d)柱温：60℃；e)漂移管温度：75℃；f)气体压力：40psi；g)喷雾器模式：加热，动力水平为60%；h)进样量：3µL。表1梯度洗脱条件（A，0.1%三乙胺-乙腈溶液；B，水）时间（min）流速（mL/min）A(%)B(%)初始0.25901030.259010100.258020230.258020GH/T1316—20204260.256535280.256535290.259010350.2590108.2.2液相色谱测定将标准工作液（5.7）按照上述色谱条件上机测定，记录色谱峰峰高或峰面积，以峰面积或峰高为纵坐标，以标准工作溶液浓度为横坐标，采用幂函数方程绘制标准曲线，或根据色谱工作站自动化计算。在上述色谱条件下，松二糖、异麦芽糖、吡喃葡糖基蔗糖、松三糖和蜜三糖的参考保留时间为分别为：13.6min、17.9min、21.9min、22.5min和25.6min，其标准工作溶液和代表性样品的色谱图见附录B.1和B.2。8.3平行试验按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。8.4空白试验除不称取样品外，均按上述步骤进行。9结果计算结果按照色谱工作站自动计算或按式（1）计算：X=C×V………………（1）m式中：X—试样中被测组分含量，单位为克每百克（g/100g）；C—从标准工作曲线上得到的被测组分溶液浓度，单位为克每百毫升（g/100mL）；V—样品溶液定容体积，单位为毫升（mL）；m—所称试样的质量，单位为克（g）。注：计算结果应扣除空白值10定量限本文件中松二糖、松三糖、吡喃葡糖基蔗糖、异麦芽糖和蜜三糖的定量限均为0.2g/100g。11精密度平行试验两次测定的绝对差值不超过其算数平均值的10%。GH/T1316—20205附录A（资料性）松二糖、松三糖、吡喃葡糖基蔗糖、异麦芽糖和蜜三糖标准物质信息松二糖、松三糖、吡喃葡糖基蔗糖、异麦芽糖和蜜三糖标准物质信息参见表A.1。表A.1松二糖、松三糖、吡喃葡糖基蔗糖、异麦芽糖和蜜三糖标准物质信息中文名称英文名称CASNo.分子式相对分子质量松二糖Turanose547-25-1C12H22O11342.30松三糖Mellzitose597-12-6C18H32O16504.44吡喃葡糖基蔗糖Erlose13101-54-7C18H32O16504.44异麦芽糖Isomaltose499-40-1C12H22O11342.30蜜三糖Raffinose512-69-6C18H32O16504.44GH/T1316—20206附录B（资料性）松二糖、松三糖、吡喃葡糖基蔗糖、异麦芽糖和蜜三糖标准工作溶液和代表性样品的色谱图松二糖、松三糖、吡喃葡糖基蔗糖、异麦芽糖和蜜三糖标准工作溶液的色谱图参见图B.1。图B.1松二糖、松三糖、吡喃葡糖基蔗糖、异麦芽糖和蜜三糖标准工作溶液（0.1g/100mL）的液相色谱-蒸发光检测色谱图代表性样品（洋槐蜜）的液相色谱-蒸发光检测色谱图见图B.2。图B.2代表性样品（洋槐蜜）的液相色谱-蒸发光检测色谱图松二糖异麦芽糖吡喃葡糖基蔗糖松三糖蜜三糖LSU0.0012.0024.0036.0048.00分钟12.0015.0018.0021.0024.0027.00松二糖异麦芽糖吡喃葡糖基蔗糖松三糖LSU0.0015.0030.0045.0060.00分钟12.0015.0018.0021.0024.0027.00异麦芽糖吡喃葡糖基蔗糖松三糖LSU0.000.601.201.80分钟16.5018.0019.5021.0022.5024.00