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书书书犐犆犛０７．０８０犆犆犛犃４０中华人民共和国国家标准犌犅／犜４０９８０—２０２１生化制品中还原糖的测定柱前衍生高效液相色谱法犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狉犲犱狌犮犻狀犵狊狌犵犪狉犻狀犫犻狅犮犺犲犿犻犮犪犾狆狉狅犱狌犮狋狊—犎犻犵犺狆犲狉犳狅狉犿犪狀犮犲犾犻狇狌犻犱犮犺狉狅犿犪狋狅犵狉犪狆犺狔狑犻狋犺狆狉犲犮狅犾狌犿狀犱犲狉犻狏犪狋犻狕犪狋犻狅狀 ２０２１１１２６发布２０２２０６０１实施国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会发布书书书前 言 本文件按照ＧＢ／Ｔ１．１—２０２０《标准化工作导则 第１部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国生化检测标准化技术委员会（ＳＡＣ／ＴＣ３８７）提出并归口。本文件起草单位：中国测试技术研究院生物研究所、深圳市分析测试协会、甘肃中商食品质量检验检测有限公司、西华大学、电子科技大学、青岛科技大学、中国测试技术研究院。本文件主要起草人：刘明东、许洋、管驰、杨锐、陈鹏、黄玉坤、蒋子敬、周鑫魁、马丽侠、程玉华、钱滢文、吴微、杨杰、王力均、叶德萍、陈凯、张简、张永勤、洪霞、周李华。Ⅰ犌犅／犜４０９８０—２０２１生化制品中还原糖的测定柱前衍生高效液相色谱法１ 范围本文件规定了采用柱前衍生高效液相色谱法测定生化制品中Ｄ甘露糖、Ｄ核糖、Ｌ鼠李糖、Ｄ半乳糖、Ｌ阿拉伯醛糖、Ｄ木糖、Ｌ岩藻糖、Ｄ葡萄糖、Ｄ麦芽糖、Ｄ乳糖１０种还原糖的测定方法。本文件适用于含糖胃蛋白酶、静脉注射用人免疫球蛋白、狂犬病人免疫球蛋白、改良Ｙ培养基、葡萄糖肉汤培养基、缓冲动力硝酸盐、木糖明胶培养基等生化制品中的甘露糖、核糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、岩藻糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖含量测定。２ 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法３ 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。４ 原理样品中的还原糖经沸水提取，提取液与１苯基３甲基５吡唑啉酮（ＰＭＰ）在碱性条件下反应，生成糖衍生物，经液相色谱分离紫外检测器测定，色谱保留时间定性、外标法定量。５ 试剂或材料除特殊说明外，本方法所用试剂除流动相为色谱纯外均为分析纯，试验用水均为ＧＢ／Ｔ６６８２规定的一级水。５．１ 磷酸二氢钾（ＫＨ２ＰＯ４）。５．２ 氢氧化钠（ＮａＯＨ）。５．３ 亚铁氰化钾［Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６·３Ｈ２Ｏ］。５．４ 乙酸锌［Ｚｎ（ＣＨ３ＣＯＯ）２·２Ｈ２Ｏ］。５．５ １苯基３甲基５吡唑啉酮（Ｃ１０Ｈ１０Ｎ２Ｏ，ＰＭＰ）。５．６ 盐酸（ＨＣｌ）。５．７ 三氯甲烷（ＣＨＣｌ３）。５．８ 甲醇（ＣＨ３ＯＨ）。５．９ 乙腈（ＣＨ３ＣＮ）：色谱纯。１犌犅／犜４０９８０—２０２１５．１０ 三乙胺（Ｃ６Ｈ１５Ｎ）。５．１１ 正己烷（Ｃ６Ｈ６）。５．１２ 亚铁氰化钾溶液（１０６ｇ／Ｌ）：称取１０６．０ｇ亚铁氰化钾，用水溶解并稀释至１０００ｍＬ。５．１３ 乙酸锌溶液（２２０ｇ／Ｌ）：称取２２０．０ｇ乙酸锌，用水稀释至１０００ｍＬ。５．１４ ０．５ｍｏｌ／Ｌ１苯基３甲基５吡唑啉酮（ＰＭＰ）衍生溶液：称取８７．１ｇＰＭＰ衍生化试剂，加甲醇溶解并定容至１０００ｍＬ。５．１５ １．０ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ溶液：称取４０．０ｇ氢氧化钠，加入水中溶解并稀释至１０００ｍＬ。５．１６ １．０ｍｏｌ／ＬＨＣｌ溶液：取８３．２ｍＬ浓盐酸，缓慢加入约８００ｍＬ水中，冷却后加水定容至１０００ｍＬ。５．１７ 糖标准品：Ｄ甘露糖（ＣＡＳ：３４５８２８４）、Ｄ核糖（ＣＡＳ：５０６９１）、Ｌ鼠李糖（ＣＡＳ：１００３０８５０）、Ｄ半乳糖（ＣＡＳ：５９２３４）、Ｌ阿拉伯醛糖（ＣＡＳ：５３２８３７０）、Ｄ木糖（ＣＡＳ：３１１７８７０８）、Ｌ岩藻糖（ＣＡＳ：２４３８８０４）、Ｄ葡萄糖（ＣＡＳ：５０９９７）、Ｄ麦芽糖（ＣＡＳ：３４５８２８４）、Ｄ乳糖（ＣＡＳ：６３４２３），纯度均≥９９％。５．１８ 混合标准储备液：分别称取１００ｍｇ标准物质（精确至０．１ｍｇ），用水溶解并定容至１００ｍＬ，配制成质量浓度约为１０００μｇ／ｍＬ的混合标准储备液，冷藏保存。５．１９ 标准工作溶液的配制：分别取０．０５ｍＬ、０．１０ｍＬ、０．２０ｍＬ、０．５ｍＬ、１ｍＬ、２ｍＬ混合标准储备液定容至１０ｍＬ容量瓶，配制成５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ和２００μｇ／ｍＬ标准溶液浓度系列。５．２０ 微孔过滤膜：孔径０．４５μｍ。６ 仪器设备６．１ 高效液相色谱仪：配紫外检测器（ＵＶ）或二极管阵列检测器（ＤＡＤ）。６．２ 分析天平：感量０．０１ｍｇ和０．０００１ｇ。６．３ 超声波提取器：功率２５０Ｗ，工作频率４０ｋＨｚ。６．４ 离心机：最大转速１５０００ｒ／ｍｉｎ。６．５ 酸度计：精度为０．０１个ｐＨ单位，ｐＨ值测定范围为０～１４。６．６ 数显恒温水浴锅：精确度到０．１℃。６．７ 涡旋混匀器。６．８ 电动粉碎机。７ 分析步骤７．１ 样品制备取有代表性的样品至少５０ｇ，固体样品（液体样品混匀直接待用）用电动粉碎机粉碎（过孔径为０．３ｍｍ的筛），混匀后装入洁净的盛样容器内，作为试样，室温密封储存。７．２ 样品前处理７．２．１ 固体样品前处理称取样品５ｇ（精确到０．００１ｇ）于５０ｍＬ离心管中，加入２０ｍＬ水，在沸水浴中提取３０ｍｉｎ，超声提取１０ｍｉｎ；样液泠却后，加入正己烷５ｍＬ，涡旋２ｍｉｎ，于５０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃去正己烷层，将水层清液倒入５０ｍＬ容量瓶中；向固体残渣中加入１０ｍＬ水，涡旋２ｍｉｎ，于５０００ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ，水２犌犅／犜４０９８０—２０２１层合并于上述５０ｍＬ容量瓶中，加入５ｍＬ亚铁氰化钾溶液，５ｍＬ乙酸锌溶液，用水定容，混匀，离心取上清液，经０．４５ｍ滤膜过滤后待用。７．２．２ 含油脂及蛋白类液体样品前处理称取样品５ｇ（精确到０．００１ｇ）于５０ｍＬ离心管中，加入２０ｍＬ水，在沸水浴中提取１５ｍｉｎ，超声提取１０ｍｉｎ，样液冷却后，加入３ｍＬ亚铁氰化钾溶液，３ｍＬ乙酸锌溶液，用水定容至４０ｍＬ，充分振摇离心管，于５０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ；取部分澄清水层，加入正己烷５ｍＬ，振摇或涡旋２ｍｉｎ，于５０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ。取水层清液，经０．４５μｍ滤膜过滤后待用。７．２．３ 不含油脂及蛋白类液体样品前处理称取样品５ｇ（精确到０．００１ｇ）于５０ｍＬ离心管中，加水至４０ｍＬ，在沸水浴中提取１５ｍｉｎ，超声提取１０ｍｉｎ，样液泠却后，转移至５０ｍＬ容量瓶中定容，取水层清液经０．４５μｍ滤膜过滤后待用。７．３ 试样衍生分别吸取试样和不同浓度的标准工作溶液０．４ｍＬ于１５ｍＬ具塞试管中，加入１．０ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ溶液０．２ｍＬ，０．５ｍｏｌ／ＬＰＭＰ衍生溶液１．０ｍＬ，在７０℃恒温水浴中反应６０ｍｉｎ；冷却至室温，加入１．０ｍｏｌ／ＬＨＣｌ溶液０．２ｍＬ，摇匀后，氮气吹干；加入２ｍＬ蒸馏水复溶，再加入２ｍＬ三氯甲烷，充分涡旋后静置或离心，弃去下层有机层，重复此操作三次，取上层水相过０．４５μｍ滤膜后进入液相色谱分析。７．４ 仪器色谱参考条件仪器色谱参考条件如下：ａ） 色谱柱：Ｃ１８色谱柱，２５０ｍｍ×４．６ｍｍ，３．０μｍ，或同等性能的色谱柱；ｂ） 流动相：Ａ相为含２０ｍｍｏｌ／ＬＫＨ２ＰＯ４（三乙胺调节ｐＨ值至７．８±０．１）水溶液，Ｂ相为乙腈，梯度条件见表１；ｃ） 流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ；ｄ） 柱温：３５℃；ｅ） 检测器波长：２５０ｎｍ；ｆ） 进样量：１０μＬ。表１ 梯度洗脱参考条件时间／ｍｉｎ流量／（ｍＬ／ｍｉｎ）流动相Ａ／％流动相Ｂ／％０１．０８４１６３５１．０７８２２３９１．０２０８０４０１．０２０８０５０１．０８４１６７．５ 标准曲线的制作以标准工作溶液中目标还原糖的浓度为横坐标，以响应值为纵坐标，绘制标准工作曲线。１０种还原糖标准品色谱图见附录Ａ中图Ａ．１。７．６ 样品的测定将待测样品液上机测定，记录色谱图，根据保留时间定性，记录峰面积，根据标准曲线计算待测样品３犌犅／犜４０９８０—２０２１液中糖的浓度。８ 分析结果计算与表示试样中还原糖含量按照式（１）计算：犡＝ρ×犞×犓×１０－６×１００犿…………………………（１） 式中：犡———样品中还原糖的含量，单位为克每一百克（ｇ／１００ｇ）；ρ———从标准工作曲线上得到的被测组分溶液质量浓度，单位为微克每毫升（μｇ／ｍＬ）；犞———样品溶液定容体积，单位为毫升（ｍＬ）；犓———样品稀释倍数；犿———所称试样的质量，单位为克（ｇ）。计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。９ 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的１０％。１０ 其他本方法测定１０种糖标准品的参考检出限和定量限见表２。表２ １０种糖标准品检出限和定量限序号化合物检出限／（μｇ／ｍＬ）定量限／（μｇ／ｍＬ）１甘露糖０．２３４０．７０２２核糖０．２４１０．７２３３鼠李糖０．２３７０．７１１４乳糖０．４５１１．３５３５麦芽糖０．４５４１．３６２６葡萄糖０．２１４０．６４２７半乳糖０．３２３０．９６９８木糖０．２１００．６３０９阿拉伯糖０．１９３０．５７９１０岩藻糖０．３１８０．９５４４犌犅／犜４０９８０—２０２１附 录 犃（资料性）液相色谱图还原糖衍生化标准品色谱图典型图见图Ａ．１。 标引序号说明：１———甘露糖；２———核糖；３———鼠李糖；４———乳糖；５———麦芽糖；６———葡萄糖；７———半乳糖；８———木糖；９———阿拉伯糖；１０———岩藻糖。图犃．１ １０种还原糖衍生物的出峰时间图５犌犅／犜４０９８０—２０２１