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书书书中华人民共和国国家标准犌犅４７８９．２—２０２２食品安全国家标准食品微生物学检验 菌落总数测定２０２２０６３０发布２０２２１２３０实施中华人民共和国国家卫生健康委员会国家市场监督管理总局发布书书书犌犅４７８９．２—２０２２Ⅰ 前 言 本标准代替ＧＢ４７８９．２—２０１６《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》。本标准与ＧＢ４７８９．２—２０１６相比，主要变化如下：———增加了附录Ｂ；———修改了设备和材料；———修改了培养基和试剂；———修改了检验程序；———修改了操作步骤；———修改了附录Ａ。犌犅４７８９．２—２０２２１ 食品安全国家标准食品微生物学检验 菌落总数测定１ 范围本标准规定了食品中菌落总数（Ａｅｒｏｂｉｃｐｌａｔｅｃｏｕｎｔ）的测定方法。本标准适用于食品中菌落总数的测定。２ 术语和定义２．１ 菌落总数 犪犲狉狅犫犻犮狆犾犪狋犲犮狅狌狀狋食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每ｇ（ｍＬ）检样中形成的微生物菌落总数。３ 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：ａ） 恒温培养箱：３６℃±１℃，３０℃±１℃。ｂ） 冰箱：２℃～５℃。ｃ） 恒温装置：４８℃±２℃。ｄ） 天平：感量为０．１ｇ。ｅ） 均质器。ｆ） 振荡器。ｇ） 无菌吸管：１ｍＬ（具０．０１ｍＬ刻度）、１０ｍＬ（具０．１ｍＬ刻度）或微量移液器及吸头。ｈ） 无菌锥形瓶：容量２５０ｍＬ、５００ｍＬ。ｉ）无菌培养皿：直径９０ｍｍ。ｊ） ｐＨ计或ｐＨ比色管或精密ｐＨ试纸。ｋ） 放大镜或／和菌落计数器。４ 培养基和试剂４．１ 平板计数琼脂培养基：见Ａ．１。４．２ 菌落总数测试片：应符合ＧＢ４７８９．２８中平板计数琼脂培养基质量控制要求，且主要营养成分与平板计数琼脂培养基配方一致。４．３ 无菌磷酸盐缓冲液：见Ａ．２。４．４ 无菌生理盐水：见Ａ．３。５ 检验程序菌落总数的检验程序见图１。犌犅４７８９．２—２０２２２ 图１ 菌落总数的检验程序６ 操作步骤６．１ 样品的稀释６．１．１ 固体和半固体样品：称取２５ｇ样品置于盛有２２５ｍＬ无菌磷酸盐缓冲液或无菌生理盐水的无菌均质杯内，８０００ｒ／ｍｉｎ～１００００ｒ／ｍｉｎ均质１ｍｉｎ～２ｍｉｎ，或放入盛有２２５ｍＬ稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打１ｍｉｎ～２ｍｉｎ，制成１∶１０的样品匀液。６．１．２ 液体样品：以无菌吸管吸取２５ｍＬ样品置于盛有２２５ｍＬ无菌磷酸盐缓冲液或无菌生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，或放入盛有２２５ｍＬ稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打１ｍｉｎ～２ｍｉｎ，制成１∶１０的样品匀液。当结果要求为每ｇ样品中菌落总数时，按６．１．１操作。犌犅４７８９．２—２０２２３ ６．１．３ 用１ｍＬ无菌吸管或微量移液器吸取１∶１０样品匀液１ｍＬ，沿管壁缓慢注于盛有９ｍＬ稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），在振荡器上振荡混匀，制成１∶１００的样品匀液。６．１．４ 按６．１．３操作，制备１０倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用１次１ｍＬ无菌吸管或吸头。６．１．５ 根据对样品污染状况的估计，选择１个～３个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），吸取１ｍＬ样品匀液于无菌培养皿内，每个稀释度做两个培养皿。同时，分别吸取１ｍＬ空白稀释液加入两个无菌培养皿内作空白对照。６．１．６ 及时将１５ｍＬ～２０ｍＬ冷却至４６℃～５０℃的平板计数琼脂培养基（可放置于４８℃±２℃恒温装置中保温）倾注培养皿，并转动培养皿使其混合均匀。６．２ 培养６．２．１ 水平放置待琼脂凝固后，将平板翻转，３６℃±１℃培养４８ｈ±２ｈ。水产品３０℃±１℃培养７２ｈ±３ｈ。如果样品中可能含有在琼脂培养基表面蔓延生长的菌落，可在凝固后的琼脂培养基表面覆盖一薄层平板计数琼脂培养基（约４ｍＬ），凝固后翻转平板，进行培养。６．２．２ 如使用菌落总数测试片，应按照测试片所提供的相关技术规程操作。６．３ 菌落计数６．３．１ 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（ｃｏｌｏｎｙｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔ，ＣＦＵ）表示。６．３．２ 选取菌落数在３０ＣＦＵ～３００ＣＦＵ之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于３０ＣＦＵ的平板记录具体菌落数，大于３００ＣＦＵ的可记录为多不可计。６．３．３ 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无较大片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，可计算半个平板后乘以２，代表一个平板菌落数。６．３．４ 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。７ 结果与报告７．１ 菌落总数的计算方法７．１．１ 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每ｇ（ｍＬ）样品中菌落总数结果，示例见Ｂ．１。７．１．２ 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按式（１）计算，示例见Ｂ．２。犖＝∑犆（狀１＋０．１狀２）犱…………………………（１） 式中：犖 ———样品中菌落数；∑犆———平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；狀１———第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；狀２———第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；犱———稀释因子（第一稀释度）。７．１．３ 若所有稀释度的平板上菌落数均大于３００ＣＦＵ，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算，示例见Ｂ．３。犌犅４７８９．２—２０２２４ ７．１．４ 若所有稀释度的平板菌落数均小于３０ＣＦＵ，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算，示例见Ｂ．４。７．１．５ 若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于１乘以最低稀释倍数计算，示例见Ｂ．５。７．１．６ 若所有稀释度的平板菌落数均不在３０ＣＦＵ～３００ＣＦＵ之间，其中一部分小于３０ＣＦＵ或大于３００ＣＦＵ时，则以最接近３０ＣＦＵ或３００ＣＦＵ的平均菌落数乘以稀释倍数计算，示例见Ｂ．６。７．２ 菌落总数的报告７．２．１ 菌落总数小于１００ＣＦＵ时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。７．２．２ 菌落总数大于或等于１００ＣＦＵ时，第三位数字采用“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字，后面用０代替位数；也可用１０的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。７．２．３ 若空白对照上有菌落生长，则此次检验结果无效。７．２．４ 称重取样以ＣＦＵ／ｇ为单位报告，体积取样以ＣＦＵ／ｍＬ为单位报告。犌犅４７８９．２—２０２２５ 附 录 犃培养基和试剂犃．１ 平板计数琼脂（狆犾犪狋犲犮狅狌狀狋犪犵犲狉，犘犆犃）培养基犃．１．１ 成分胰蛋白胨（主要营养成分） ５．０ｇ酵母浸膏（主要营养成分） ２．５ｇ葡萄糖（主要营养成分） １．０ｇ琼脂 １５．０ｇ蒸馏水 １０００ｍＬ犃．１．２ 制法将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节ｐＨ至７．０±０．２。分装于适宜容器，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ。犃．２ 无菌磷酸盐缓冲液犃．２．１ 成分磷酸二氢钾（ＫＨ２ＰＯ４） ３４．０ｇ蒸馏水 ５００ｍＬ犃．２．２ 制法贮存液：称取３４．０ｇ的磷酸二氢钾溶于５００ｍＬ蒸馏水中，用大约１７５ｍＬ的１ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液调节ｐＨ至７．２，用蒸馏水稀释至１０００ｍＬ后贮存于冰箱。稀释液：取贮存液１．２５ｍＬ，用蒸馏水稀释至１０００ｍＬ，分装于适宜容器中，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ。犃．３ 无菌生理盐水犃．３．１ 成分氯化钠 ８．５ｇ蒸馏水 １０００ｍＬ犃．３．２ 制法称取８．５ｇ氯化钠溶于１０００ｍＬ蒸馏水中，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ。犌犅４７８９．２—２０２２６ 附 录 犅示 例犅．１ 示例１稀释度１∶１０１∶１００１∶１０００计算结果菌落数／ＣＦＵ多不可计，多不可计１２４，１３８１１，１４１３１００ 上述数据按７．２．２数字修约后，表示为１３０００或１．３×１０４。犅．２ 示例２稀释度１∶１００（第一稀释度）１∶１０００（第二稀释度）计算结果菌落数／ＣＦＵ２３２，２４４３３，３５２４７２７ 上述数据按７．２．２数字修约后，表示为２５０００或２．５×１０４。犅．３ 示例３稀释度１∶１０１∶１００１∶１０００计算结果菌落数／ＣＦＵ多不可计，多不可计多不可计，多不可计４４２，４２０４３１０００ 上述数据按７．２．２数字修约后，表示为４３００００或４．３×１０５。犅．４ 示例４稀释度１∶１０１∶１００１∶１０００计算结果菌落数／ＣＦＵ１４，１５１，００，０１４５ 上述数据按７．２．２数字修约后，表示为１５０或１．５×１０２。犅．５ 示例５稀释度１∶１０１∶１００１∶１０００计算结果菌落数／ＣＦＵ０，００，００，０＜１０ 上述数据表示为＜１０。犌犅４７８９．２—２０２２７ 犅．６ 示例６稀释度１∶１０１∶１００１∶１０００计算结果菌落数／ＣＦＵ３１２，３０６１４，１９２，４３０９０ 上述数据按７．２．２数字修约后，表示为３１００或３．１×１０３。