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书书书犐犆犛０７．０８０犃２１!#$%&’’()*犌犅／犜３８４７５—２０２０!#$%&’()*+,-./0犇犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犿狔犮狅狋狅狓犻狀狊犻狀狆犻犵犿犲狀狋—犚犪狆犻犱狇狌犪狀狋犻狋犪狋犻狏犲犿犲狋犺狅犱狅犳犮狅犾犾狅犻犱犪犾犵狅犾犱狊狋狉犻狆狋犲狊狋２０２０１１１９12２０２０１１１９34’(+,-./012’()*3/045612书书书前 言 本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由中国标准化研究院提出并归口。本标准起草单位：中国计量大学、中国标准化研究院、江南大学、北京萨姆伯科技有限公司。本标准主要起草人：崔海峰、叶子弘、马爱进、刘丽强、张明洲、俞晓平、许益鹏、申屠旭萍、张雅芬、匡华、郝帅。Ⅰ犌犅／犜３８４７５—２０２０色素中生物毒素检测胶体金快速定量法１ 范围本标准规定了用胶体金快速定量法检测天然色素产品中生物毒素的方法。本标准适用于基于天然产物提取及发酵制备的天然色素产品中黄曲霉素Ｂ１、桔青霉素、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素的快速定量检测。２ 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ５４９１ 粮食、油料检验 扦样、分样法ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法３ 原理试样提取液中的生物毒素在层析过程中与检测试剂条中胶体金微粒标记的特异性抗体竞争结合并发生呈色反应，颜色深浅与试样中生物毒素含量相关。用读数仪检定检测条上检测线和质控线颜色深浅，根据颜色深浅和读数仪内置曲线自动计算出试样中生物毒素含量。４ 试剂或材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯。４．１ 水ＧＢ／Ｔ６６８２，二级水。４．２ 黄曲霉毒素犅１纯度≥９８％。４．３ 桔青霉素纯度≥９８％。４．４ 玉米赤霉烯酮纯度≥９８％。４．５ 呕吐毒素纯度≥９８％。１犌犅／犜３８４７５—２０２０４．６ 苯＋乙腈混合液量取９８．０ｍＬ苯，加２．０ｍＬ乙腈，混匀。４．７ 稀释缓冲液称取２．４２２８ｇ三羟甲基氨基甲烷，加水溶解，调ｐＨ＝８．０；加入９．０ｇ氯化钠、５ｍＬＴｒｉｔｏｎＸ１００，用水定容至１０００ｍＬ；或采用商品化的同类产品。４．８ ７０％（体积分数）甲醇溶液提取液取７０．０ｍＬ的甲醇加水３０．０ｍＬ，混匀。４．９ 犘犅犛缓冲溶液称取８．０ｇ氯化钠、１．２ｇ磷酸氢二钠、０．２ｇ磷酸二氢钾、０．２ｇ氯化钾，用水溶解，调节ｐＨ至７．０，用水定容至１０００ｍＬ。４．１０ ０．１％（体积分数）吐温２０犘犅犛溶液移取１ｍＬ吐温２０，以ＰＢＳ缓冲溶液定容至１０００ｍＬ。４．１１ ０．１％（体积分数）磷酸溶液准确移取１ｍＬ磷酸，加水定容至１０００ｍＬ。４．１２ ０．１犿犵／犔的生物毒素标准储备液分别准确称取一定量的生物毒素标准品，用苯＋乙腈（９８∶２）溶液溶解，容量瓶定容至１０ｍＬ，配制０．１ｍｇ／Ｌ的生物毒素标准储备液，保存于４℃备用，可保存１年。５ 仪器设备５．１ 天平：精度０．０１ｇ和０．０１ｍｇ。５．２ 粉碎机：转速不低于３０００ｒ／ｍｉｎ。５．３ 离心机：转速不低于３０００×犵。５．４ 涡旋振荡器。５．５ 读数仪：可测定并显示胶体金免疫层析试纸条的检测结果。５．６ 胶体金免疫层析检测试纸条：性能要求见附录Ａ。５．７ 微量移液器。５．８ 免疫亲和柱：柱体积规格１ｍＬ或３ｍＬ，柱容量不低于２００ｎｇ，或等效柱。６ 样品制备６．１ 试样取样按照ＧＢ／Ｔ５４９１执行。２犌犅／犜３８４７５—２０２０６．２ 试样制备６．２．１ 固体样品天平称取有代表性的固体或样品５００ｇ，其中３００ｇ用粉碎机粉碎至全部通过２０目筛，混匀，分两份密封冷冻保存。取一份保存样品准确称取２．０ｇ试样于１０ｍＬ具塞锥形瓶中，加入２０．０ｍＬ７０％甲醇溶液提取液，密闭，用涡旋振荡器振荡２ｍｉｎ～３ｍｉｎ，静置后用滤纸过滤，或取１．５ｍＬ混合液于离心管中，用离心机离心１ｍｉｎ。取滤液或离心后上清液１００μＬ于另一离心管中，加９００μＬ于稀释缓冲液，充分混匀待测。如样品为特殊材料，需将稀释后的混合液用针头过滤器过滤，即为待测液。６．２．２ 液体样品液体待测样品用均质器，处理不少于２ｍｉｎ，充分混匀后，用微量移液器分别吸取１．０ｍＬ加入２个２．０ｍＬ离心管中，一份密封冷冻保存，一份用于检测。从待测离心管中吸取２００μＬ离心液体样品于另一离心管中，加入１．８ｍＬ稀释缓冲液，充分混匀待测。６．２．３ 净化将免疫亲和柱连接在１０ｍＬ玻璃针筒下，准确移取１０．０ｍＬ上述样品滤液过免疫亲和柱，以１滴／ｓ～２滴／ｓ的流速全部通过亲和柱；加入１０ｍＬ０．１％吐温２０ＰＢＳ溶液，以１滴／ｓ～２滴／ｓ的流速淋洗柱子，直至空气进入到亲和柱中，弃去全部流出液。准确加入１．０ｍＬ洗脱液进行洗脱，洗脱流速为１滴／ｓ～２滴／ｓ。收集全部洗脱液于离心管中备用。注：净化处理仅针对红曲红等对胶体金反应结果产生严重背景干扰的色素产品。７ 测定７．１ 低温保存的检测试纸条取出后，室温放置２０ｍｉｎ～３０ｍｉｎ。７．２ 胶体金试剂条：将试纸条浸入含３００μＬ～５００μＬ待测溶液的离心管中，室温孵育５ｍｉｎ。７．３ 胶体金检测卡：将６０μＬ～８０μＬ待测溶液加入到检测孔中，室温孵育５ｍｉｎ。７．４ 宜选择胶体金检测试纸条或检测卡生产厂家的读数仪配套使用。８ 结果分析８．１ 反应结束后，取出胶体金免疫层析检测试纸条或检测卡观察Ｃ线（质控线）和Ｔ线（检测线）的显色情况。若出现Ｃ线不出现，或Ｃ线出现但弥散或严重不均匀，或Ｃ线出现但Ｔ线弥散或严重不均匀，均视为无效检测。８．２ 调整读数仪参数，固定好胶体金检测试纸条或检测卡，对目标毒素进行检测，测定需要在２ｍｉｎ内完成，重复测定３次，读数仪根据内置拟合曲线自动计算并显示样品中相应生物毒素的含量，单位为微克每千克（μｇ／ｋｇ）或微克每升（μｇ／Ｌ）。８．３ 在相应生物毒素的检测范围内，基于阴性对照样品，设置空白样品添加的不同浓度梯度，其中黄曲霉毒素Ｂ１浓度范围为２μｇ／ｋｇ～１２８μｇ／ｋｇ；桔青霉素浓度范围为４０μｇ／ｋｇ～６４０μｇ／ｋｇ；呕吐毒素浓度范围为３００μｇ／ｋｇ～１４４００μｇ／ｋｇ；玉米赤霉烯酮浓度范围为４０μｇ／ｋｇ～１９２０μｇ／ｋｇ。基于标准样品浓度值与代表Ｔ线强度光密度值的积分面积检测数据，采用四参数ｌｏｇｉｓｔｉｃ拟合算法建立标准曲线，拟合程度犚２值应在０．９９以上。３犌犅／犜３８４７５—２０２０９ 重复性在重复性条件下获得的２次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的２０％。１０ 其他本方法检出限黄曲霉毒素Ｂ１２．０μｇ／ｋｇ，桔青霉素４０μｇ／ｋｇ，玉米赤霉烯酮６０μｇ／ｋｇ，呕吐毒素５００μｇ／ｋｇ。４犌犅／犜３８４７５—２０２０附 录 犃（规范性附录）胶体金快速检测试纸条性能要求犃．１ 准确性采用最低检测限２倍、５倍、８倍浓度水平的实物标准样品，每个浓度水平测定不低于６次。计算检测条检测结果与实物标准样品的偏差，３个浓度水平的偏差均应控制在－２０％～＋２０％之间。犃．２ 精密度采用最低检测限５倍浓度水平的实物标准样品，测定不低于６次，计算检测条批次内变异系数，变异系数≤２０％。犃．３ 检测限测定２０份阴性样品，计算平均值加３倍标准差，其结果应小于或等于产品灵敏度标示值。犃．４ 批间稳定性采用约１０μｇ／ｋｇ浓度水平的实物标准样品进行检测，不得低于６个批次，每个批次测定不低于２次，批内测定取平均值，计算检测条批间变异系数，变异系数应小于或等于２０％。犃．５ 特异性选取阴性待测样品，加入与目标检测生物毒素可能存在交叉反应的其他生物毒素，除目标检测生物毒素添加样品检测结果为阳性外，其余添加样品测定结果均为阴性。５犌犅／犜３８４７５—２０２０