GB 5009.284-2021 食品安全国家标准 食品中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的测

中华人民共和国国家标准GB5009.284—2021食品安全国家标准食品中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的测定2021-09-07发布2022-03-07实施中华人民共和国国家卫生健康委员会国家市场监督管理总局发布GB5009.284—20211食品安全国家标准食品中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的测定1范围本标准规定了食品中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的测定方法。本标准适用于婴幼儿配方食品、婴幼儿辅助食品、糕点、糖果、乳及乳制品、饮料、小麦粉中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的测定。第一法液相色谱法2原理试样加水混匀后,加入乙腈超声提取,经液相色谱分离,紫外检测器或二极管阵列检测器检测,外标法定量。3试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。3.1试剂与材料3.1.1乙腈(CH3CN):色谱纯。3.1.2甲酸(HCOOH):色谱纯。3.1.3甲醇(CH3OH):色谱纯。3.1.4氯化钠(NaCl)。3.1.5浓盐酸(HCl):12mol/L。3.1.6微孔滤膜:0.45μm,有机相型。3.2试剂配制3.2.10.1%甲酸甲醇溶液:吸取1mL甲酸溶于甲醇并稀释至1000mL,临用现配。3.2.2盐酸溶液(1mol/L):吸取8.33mL浓盐酸,溶于水并稀释至100mL,临用现配。3.2.3甲醇-水溶液(4+1):将甲醇和水按4∶1(体积比)混合均匀。3.2.40.5%甲酸溶液:吸取5mL甲酸,溶于水并稀释至1000mL,临用现配。3.3标准品3.3.1香兰素标准品(C8H8O3,CAS号:121-33-5):纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。GB5009.284—202123.3.2甲基香兰素标准品(C9H10O3,CAS号:120-14-9):纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。3.3.3乙基香兰素标准品(C9H10O3,CAS号:121-32-4):纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。3.3.4香豆素标准品(C9H6O2,CAS号:91-64-5):纯度≥97%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。3.4标准溶液配制3.4.1标准储备液(1000mg/L):准确称取香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、香豆素各10mg(精确至0.1mg),分别置于10mL容量瓶中,用0.1%甲酸甲醇溶液溶解并定容至刻度,混匀。将溶液转移至棕色玻璃容器内,-18℃下避光保存,保存期8个月。3.4.2标准混合中间液(10mg/L):吸取香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、香豆素的标准储备液(1000mg/L)各1.00mL,置于100mL容量瓶中,加0.1%甲酸甲醇定容至刻度,混匀。将溶液转移至棕色玻璃容器中,-18℃下避光保存,保存期3个月。3.4.3标准混合系列工作液:分别吸取标准混合中间液(10mg/L)0.2mL、1.0mL、5.0mL,置于10mL容量瓶中,另分别吸取香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、香豆素的标准储备液(1000mg/L)0.2mL、0.5mL和1mL,置于10mL容量瓶中,加甲醇-水溶液定容至刻度,混匀。标准混合系列工作液的浓度分别为0.2mg/L、1.0mg/L、5.0mg/L、20.0mg/L、50.0mg/L、100.0mg/L,临用现配。4仪器和设备4.1液相色谱仪:配有二极管阵列或紫外检测器。4.2天平:感量分别为0.1mg和0.01g。4.3涡旋混合器。4.4离心机。4.5氮气浓缩装置。4.6超声波发生器。5分析步骤5.1样品前处理5.1.1试样制备液态试样摇匀;基质均匀的半固态试样和粉状试样直接用于5.1.2试样提取;其他试样需匀浆或粉碎均匀。5.1.2试样提取5.1.2.1婴幼儿配方食品、婴幼儿辅助食品称取1.00g试样,加入10mL水和480μL盐酸溶液,涡旋振荡1min,加入20mL乙腈,涡旋振荡1min,超声提取30min后,加入5g氯化钠,涡旋振荡2min,8000r/min离心5min,取上清液至玻璃试管,40℃氮吹至近干,准确加入1.0mL甲醇-水溶液溶解残渣,过0.45μm微孔滤膜后,待测。GB5009.284—202135.1.2.2糕点、糖果、乳及乳制品、饮料称取1.00g试样,加入5mL水(胶基糖果加入10mL水,50℃水浴溶解),涡旋振荡1min,加入20mL乙腈,涡旋振荡1min,超声提取30min后,加入5g氯化钠,涡旋振荡2min,8000r/min离心5min(对于含油脂高的糕点样品,采取冷冻离心,8000r/min),取上清液至玻璃试管,40℃氮吹至近干,准确加入1.0mL甲醇-水溶液溶解残渣,过0.45μm微孔滤膜后,待测。5.1.2.3小麦粉称取1.00g试样,加入10mL水和240μL盐酸溶液,涡旋振荡1min,加入20mL乙腈,涡旋振荡1min,超声提取30min后,加入5g氯化钠,涡旋振荡2min,8000r/min离心5min,取上清液至玻璃试管,40℃氮吹至近干,准确加入1.0mL甲醇-水溶液溶解残渣,过0.45μm微孔滤膜后,待测。5.2仪器参考条件5.2.1色谱柱:C18柱,250mm×4.6mm(内径),5μm(填料粒径)或相当者。5.2.2柱温:30℃。5.2.3进样量:10μL。5.2.4检测波长:279nm。5.2.5流速:1.0mL/min。5.2.6流动相A相:0.5%甲酸溶液;B相:乙腈。梯度洗脱见表1。表1梯度洗脱程序时间/minA/%B/%0.055455.040605.110908.010909.1554514.055455.3标准曲线的制作将标准混合系列工作液分别注入液相色谱仪中,测定相应的峰面积,以标准系列工作液中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的浓度为横坐标,以峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、香豆素标准溶液的色谱图参见附录A中图A.1。5.4试样溶液的测定将试样溶液注入液相色谱仪中,得到峰面积,根据标准曲线得到试样溶液中被测化合物的浓度。GB5009.284—202146分析结果的表述试样中被测化合物的含量按式(1)计算。Xi=ρ×V×1000m×1000……………………(1)式中:Xi———试样中被测化合物的含量,单位为毫克每千克(mg/kg);ρ———由标准曲线得到的试样溶液中被测化合物的浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);V———试样最终定容体积,单位为毫升(mL);m———试样的取样量,单位为克(g)。1000———换算系数。注:计算结果需扣除空白值,保留小数点后两位数字。7精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。8其他本方法的检出限均为0.07mg/kg,定量限均为0.20mg/kg。第二法液相色谱-质谱/质谱法9原理试样加水混匀后,经乙腈超声提取,提取液经固相萃取柱净化后,液相色谱-质谱/质谱仪测定,内标法定量。10试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。10.1试剂及材料10.1.1乙腈(CH3CN):色谱纯。10.1.2甲酸(HCOOH):色谱纯。10.1.3甲醇(CH3OH):色谱纯。10.1.4氯化钠(NaCl)。10.1.5浓盐酸(HCl):12mol/L。10.1.6含极性基团的反相聚合物固相萃取柱:60mg、3mL,或相当者。含极性基团的反相聚合物固相萃取柱吸附剂是由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单体按照一定比例聚合成的大孔聚合物。使用前用3mL甲醇、3mL水活化。GB5009.284—2021510.1.7微孔滤膜:0.22μm,有机相型。10.2试剂配制10.2.10.1%甲酸甲醇溶液:吸取1mL甲酸溶于甲醇并稀释至1000mL,临用现配。10.2.2盐酸溶液(1mol/L):吸取8.33mL浓盐酸,溶于水并稀释至100mL,临用现配。10.2.3甲醇-水溶液(4+1):将甲醇和水按4∶1(体积比)混合均匀。10.2.40.5%甲酸溶液:吸取5mL甲酸,溶于水并稀释至1000mL,临用现配。10.3标准品10.3.1香兰素标准品(C8H8O3,CAS号:121-33-5):纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。10.3.2甲基香兰素标准品(C9H10O3,CAS号:120-14-9):纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。10.3.3乙基香兰素标准品(C9H10O3,CAS号:121-32-4):纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。10.3.4香豆素标准品(C9H6O2,CAS号:91-64-5):纯度≥97%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。10.3.5D3-香兰素标准品(C8H5D3O3,CAS号:74495-74-2):纯度≥98%。10.3.6D3-甲基香兰素标准品(C9H7D3O3,CAS号:143318-06-3):纯度≥98%。10.3.7D5-乙基香兰素标准品(C9H5D5O3,CAS号:1335401-74-5):纯度≥98%。10.3.8D4-香豆素标准品(C9H2D4O2,CAS号:185056-83-1):纯度≥98%。10.4标准溶液配制10.4.1标准储备液(1000mg/L):同3.4.1。10.4.2标准混合中间液(10mg/L):同3.4.2。10.4.3内标储备液(1000mg/L):准确称取D3-香兰素、D3-甲基香兰素、D5-乙基香兰素、D4-香豆素各10mg(精确至0.1mg),分别置于10mL容量瓶中,用0.1%甲酸甲醇溶液溶解并定容至刻度,混匀将溶液转移至棕色玻璃容器内,-18℃下避光保存,保存期8个月。10.4.4内标混合中间液(10mg/L):吸取D3-香兰素、D3-甲基香兰素、D5-乙基香兰素、D4-香豆素的标准储备液(1000mg/L)各1.00mL,置于100mL容量瓶中,加0.1%甲酸甲醇溶液定容至刻度,混匀。将溶液转移至棕色玻璃容器内,-18℃下避光保存,保存期3个月。10.4.5标准及内标混合系列工作液:分别吸取标准混合中间液(10mg/L)0.05mL、0.2mL、0.5mL、1mL、2mL和内标混合中间液(10mg/L)0.1mL,置于10mL容量瓶中,加甲醇-水溶液定容至刻度,混匀。标准及内标混合系列工作液的浓度分别为0.05mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L,内标的浓度均为0.1mg/L。临用现配。11仪器和设备11.1液相色谱串联四极杆质谱仪:配电喷雾离子源。11.2天平:感量为0.1mg和0.01g。11.3涡旋混合器。11.4离心机。11.5高速冷冻离心机。GB5009.284—2021611.6氮气浓缩装置。11.7超声波发生器。11.8固相萃取装置。12分析步骤12.1样品前处理12.1.1试样制备液态试样摇匀;基质均匀的半固态试样和粉状试样直接用于12.1.2试样提取;胶基质糖果粉碎,搅匀;其他试样需匀浆或粉碎均匀。12.1.2试样提取12.1.2.1婴幼儿配方食品、婴幼儿辅助食品称取1.00g试样,加入10μL内标混合中间液,加入10mL水和480μL盐酸溶液,涡旋振荡1min,加入20mL乙腈,涡旋振荡1min,超声提取30min后,加入5g氯化钠,涡旋振荡2min,8000r/min离心5min,取上清液至玻璃试管,待净化。12.1.2.2糕点、糖果、乳及乳制品、饮料称取1.00g试样,加入10μL内标混合中间液,加入5mL水(胶基糖果加入10mL水,50℃水浴溶解),涡旋振荡1min,加入20mL乙腈,涡旋振荡1min,超声提取30min后,加入5g氯化钠,涡旋振荡2min,8000r/min离心5min(对于含油脂高的糕点样品,采取冷冻离心,8000r/min),取上清液至玻璃试管,待净化。12.1.2.3小麦粉称取1.00g试样,加入10