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ICS65.020.20CCSB16中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1723.1—2022代替SN/T1723.1—2006SN/T1723.2—2006马铃薯金线虫和马铃薯白线虫检疫鉴定方法DetectionandidentificationofGloboderarostochiensis(Wollenweber)SkarbilovichandG.pallida(Stone)Behrans2022-07-07发布2023-02-01实施中华人民共和国海关总署发布学兔兔—2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件代替SN/T1723.1—2006《马铃薯白线虫检疫鉴定方法》、SN/T1723.2—2006《马铃薯金线虫检疫鉴定方法》,除结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下:———本文件将SN/T1723.1和SN/T1723.2在原文件基础上进行合并;———符号和缩略语增加了DGO、Ex.P.、Granek比值、Gub、Tail、VMB;———增加了分子生物学检测所必需的仪器、用具和药品;———抽样进行修改,并引用SN/T2122为规范;———增加了球孢囊线虫属形态学鉴定,包括雌虫、雄虫、2龄幼虫、球孢囊线虫属与近似属的区别;———增加了马铃薯金线虫、马铃薯白线虫与近似种的区别,替代原文件中马铃薯金线虫与马铃薯白线虫的区别;———增加了分子生物学鉴定;———结果判定在原有文件的基础上,增加了主要鉴定特征,增加了形态学特征不足以判定时结合分子生物学检测结果进行判定;———附录A在原文件基础上作了适当的合并和修改,线虫分布更新,并新增线虫为害症状的描述;———附录C系新增球孢囊线虫属与近似属区别的具体内容;———附录F系新增马铃薯金线虫、马铃薯白线虫与近似种区别的具体内容,代替SN/T1723.2中的附录C(马铃薯金线虫和马铃薯白线虫的主要区别);———附录G和附录H系新增了分子生物学鉴定的具体内容。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国上海海关、中华人民共和国重庆海关、中国检验检疫科学研究院。本文件主要起草人:宋绍禕、俞禄珍、滕少娜、葛建军、王旭、戚龙君。本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为:———SN/T1723.1—2006,2006年首次发布,本次为第一次修订;———SN/T1723.2—2006,2006年首次发布。ⅠSN/T1723.1—2022学兔兔范围本文件规定了进境植物检疫中马铃薯金线虫和马铃薯白线虫的检疫鉴定方法。本文件适用于输华的马铃薯种薯、食用马铃薯、带根或土的茄属植物及其他带根或土的植物繁殖材料中马铃薯金线虫和马铃薯白线虫的检疫鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件比不可少的条款,其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样方法3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4符号和缩略语下列符号和缩略语适用于本文件。DGO:背食道腺开口至口针基部球的距离(μm);Ex.P.:体前端至排泄孔的距离(μm);Granek比值(格氏比值):肛门到阴门膜孔边缘的最近距离/阴门膜孔直径;Gub:引带长度(μm);L:虫体体长(μm);n:测计的线虫样本数目;Spi:交合刺长度(μm);Stylet:口针长度(μm);Tail:尾长(μm);VMB:体前端至中食道球瓣的距离(μm)。5基本信息5.1马铃薯金线虫学名:Globoderarostochiensis(Wollenweber,1923),Skarbilovich,1959。异名:HeteroderaschachtiirostochiensisWollenweber,1923;HeteroderaschachtiisolaniZim-mermann,1927.英文名:Goldenpotatocystnematode,yellowpotatocystnematode,goldennematode1SN/T1723.1—2022学兔兔标准下载分类地位:线虫门(Nematoda),色矛纲(Chromadorea),色矛亚纲(Chromadoria),小杆目(Rhabo-litida),垫刃亚目(Tylenchina),垫刃总科(Tylenchoidea),纽带线虫科(Hoplolaimidae),异皮线虫亚科(Heteroderinae)、球孢囊线虫属(Globodera)。马铃薯金线虫其他信息应符合附录A的规定。5.2马铃薯白线虫学名:Globoderapallida(Stone)Behrans,1975。异名:HeteroderapallidaStone,1973。英文名:Whitepotatocystnematode,palepotatocystnematode。分类地位:同马铃薯金线虫。马铃薯白线虫其他信息应符合附录A的规定。6方法原理马铃薯金线虫和马铃薯白线虫的形态学特征是其检疫鉴定的主要依据,寄主范围、地理分布、生物学和生态学特征、传播途径是鉴定的辅助依据。马铃薯金线虫和马铃薯白线虫的寄主、分布、生活史和传播途径见附录A。7仪器、用具及试剂7.1仪器、用具生物显微镜、体视显微镜、恒温箱、漂浮筒、网筛(20目、100目、500目)、酒精灯、烧杯、三角瓶(1000mL、2000mL)、竹针、0号狼毛笔、毛刷、PCR仪、离心机、微量移液器、电泳仪、凝胶成像系统等。7.2试剂酒精、丁香油、过氧化氢(40%)、中性树胶、福尔马林(40%)、冰乙酸、甘油、三乙醇胺、乳酚油、乳酸(40%)、硫酸镁、TaqDNA聚合酶、dNTP、引物、灭菌双蒸水等。8抽样与现场检疫8.1抽样出口国和我国签订双边协定的,按双边协定的要求抽样和取样;未签订双边协定的,按SN/T2122的要求抽样和取样。8.2现场检疫检查马铃薯种薯、食用马铃薯薯块的带土情况。肉眼观察薯块基本不带土壤,则对进境的马铃薯薯块进行随机取样,带回实验室检验;肉眼观察发现薯块带有土壤,应将土壤及薯块带回实验室检验。查看带根、土的茄属植物及其他带根、土的植物繁殖材料的带土情况,收集上述植物繁殖材料和运输工具上可能携带的土壤,连同植物繁殖材料一并带回实验室检验。取样后立即置于密封塑料袋中,标记后及时送实验室。2SN/T1723.1—2022学兔兔土壤的收集使用毛刷将马铃薯等块茎和根上的土壤刷下来,尤其注意收集芽眼等内凹表面的土壤;若马铃薯种薯等繁殖材料的带土量极小,可使用少量水将块茎粘附的少量土洗刷下来。9.2线虫的分离9.2.1Fenwick-Oostenbrink漂浮法此方法一般用于检验100mL以上的泥土。具体的分离步骤如下:将现场采集到的土样铺于干净的浅瓷盘内,置于通风无阳光处风干,用手(或用小的圆木棍)将泥土轻轻压碎,用孔径为3mm的标准筛过筛,除去泥土中混杂的植物组织和粗砂等杂物后备用;将漂浮筒和下筛淋湿;漂浮筒内灌满清水;在上筛中放置风干的土壤样品100mL左右,用强水流冲洗,使土样全部被淋洗至漂浮筒内;进入筒内的土粒因较重而逐渐下沉,而较轻的孢囊和一些有机杂物则陆续向上漂浮,经1min~2min后漂浮于筒口水面之上;再由上筛加水至漂浮筒内,使漂浮于筒口的孢囊和杂物沿水槽流到下筛(100目)上面;将下筛内含孢囊的残留物冲洗至1000mL的三角瓶内,往瓶内加清水,直至瓶口处;静置片刻,待漂浮物浮于液面时,将漂浮物倒入装有滤纸的漏斗中过滤,待滤纸晾干后即可镜检。9.2.2简易漂浮法收集的土壤在100mL以下时可采用此方法分离孢囊。将上述泥土倒入2000mL的三角瓶中,加少量水(可用10%的硫酸镁溶液代替水作漂浮液使用效果更佳)后至水深5cm左右充分摇晃使之呈悬浮液,然后边加水边摇动,加水直至接近瓶口处。静置片刻,待三角瓶颈部的水变清时,将三角瓶瓶口的漂浮物通过20目和100目的套筛。彻底冲洗20目筛网,使所有的孢囊被冲到100目的筛网上。将100目筛网上的收集物轻轻地倒入装有滤纸的漏斗中过滤,待滤纸晾干后即可镜检。9.2.3直接过筛法马铃薯薯块上马铃薯孢囊线虫的分离使用该方法。将洗涤马铃薯薯块的泥水洗涤液倒入20目―100目―500目的三层套筛中,然后用水喷淋冲洗,使杂质留在20目的粗筛内,而孢囊则会被冲到100目的网筛中,500目的网筛用于收集孢囊线虫的2龄幼虫和雄虫。将100目筛网上的孢囊和残余物冲洗入三角瓶内,一并倒入装有滤纸的漏斗中过滤,待滤纸晾干后镜检。将500目筛网上的收集物冲洗到小培养皿中镜检。9.3镜检晾干后的滤纸可在体视显微镜下检查,寻找褐色近球形孢囊。若发现孢囊,则用竹针或0号狼毛笔将其挑至凹玻片上或装有白色滤纸的小培养皿中,制作阴门锥标本,并在生物显微镜下对孢囊的阴门锥进行鉴定。孢囊的阴门锥标本制作方法按附录B的规定执行。3SN/T1723.1—2022学兔兔孢囊球形,有短颈,无阴门锥,角质层厚、表面有网状花纹,有D层。阴门位于体末端,阴门区的环膜孔明显,很少有下桥和泡状突,肛门区无膜孔。所有卵都存留在体内,无卵囊。10.1.2雄虫体弯,侧线4条;交合刺长于30μm、远末端尖;尾短、呈半球形。10.1.32龄幼虫侧线4条,尾圆锥形、端尖,尾后部的透明区长约占尾长的1/2,尾感器点状。10.1.4球孢囊线虫属与近似属的区别球孢囊线虫属与刻点孢囊线虫属Punctodera、仙人掌孢囊线虫属Cactodera、孢囊线虫属Hetero-dera的主要区别特征为孢囊的形状及肛门-阴门区域的膜孔类型(见附录C)。10.2马铃薯金线虫形态学鉴定10.2.1形态特征10.2.1.1雌虫近球形,具突出的颈,虫体球形部分的角质层具有网状脊,无侧线。口针锥部约占口针长的50%,有时略弯曲,口针基部球圆形,明显向后倾斜,口针套管从头架延伸到口针长约75%处。排泄孔明显,位于颈基部。阴门膜孔略凹陷,阴门横裂状。肛门位于阴门膜孔之外,肛门与阴门间角质层有约20个平行脊。(见附录D)10.2.1.2孢囊近球形,具突出的颈,无突出的阴门锥;新孢囊的阴门区可能是完整的,但较老的孢囊标本的部分或全部阴门膜孔丢失,形成1个单环膜孔型(singlecircularfenestra)阴门膜孔。无阴门桥、下桥及其他残存的虫体腺体结构;无泡状突,但阴门区域可能有一些小而不规则黑色素沉积物。角质层花纹与雌虫相似,无亚晶层。(见附录D)10.2.1.3雄虫蠕虫形,尾短、钝圆。热力杀死固定时,虫体弯曲,后部卷曲90°~180°,呈“C”形或“S”形,角质膜具规则环纹,侧区4条侧线延伸至尾末端,两条外侧线具横纹但内侧线无横纹。头部圆、缢缩,具6个~7个环纹,头骨架高度骨化。口针强壮,基部球向后倾斜,口针锥部约占口针长的45%,口针套管从头架延伸到口针长约70%处。中食道球椭圆形,中间有明显的新月形瓣门,无明显的食道-肠瓣状结构。半月体2个体环长,位于排泄孔前2个~3个体环处,半月小体1个体环长,位于排泄孔后9个~12个体环处。单精巢,泄殖腔开口小,具突起的唇。交合刺强壮,弓形,末端尖,引带小。(见附录D)10.2.1.42龄幼虫蠕虫形,但在卵内折叠成4折,角质层环纹清晰,侧区侧线4条,偶尔有网格化。头部圆、微缢缩,具4SN/T1723.1—2022学兔兔个~6个环纹。头骨架高度骨化,前、后头状体分别位于第2或第3个和第6个~8个体环处。口针强壮,口针锥部小于口针长的50%