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ICS65.020.20CCSB16中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T5394—2022苹果根结线虫检疫鉴定方法DetectionandidentificationofMeloidogynemaliItoh,Ohshima&Ichinohe,19692022-07-07发布2023-02-01实施中华人民共和国海关总署发布学兔兔—2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:宁波检验检疫科学技术研究院、中华人民共和国宁波海关技术中心、宁波中盛产品检测有限公司。本文件主要起草人:顾建锋、方亦午、刘乐乐、陈先锋。ⅠSN/T5394—2022学兔兔范围本文件规定了进出境植物检疫中苹果根结线虫的检疫鉴定方法。本文件适用于进出境种苗、土壤、介质及植物产品等携带的苹果根结线虫的检疫鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T24829毛刺线虫属(传毒种类)检疫鉴定方法SN/T1157进出境植物苗木检疫规程SN/T2117伪哥伦比亚根结线虫检疫鉴定方法3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4基本信息学名:MeloidogynemaliItoh,Ohshima&Ichinohe,1969。英文名:Appleroot-knotnematode。分类地位:线虫门(Nematoda),色矛纲(Chromadorea),小杆目(Rhabditida),垫刃亚目(Tylenchi-na),垫刃总科(Tylenchoidea),根结科(Meloidogynidae),根结亚科(Meloidogyninae),根结线虫属(Meloidogyne)。苹果根结线虫其他相关信息见附录A。5方法原理根结线虫二龄幼虫入侵寄主根部后固着寄生,逐渐发育为卵圆形或梨形雌虫,导致寄主根部膨大呈根瘤状(见附录B)。因此,如现场检疫时在植物根部发现疑似根结,可直接剖检寻找雌虫,也可从寄主植物根系及根围土壤或介质中分离获得二龄幼虫或雄虫后,进一步用形态学或分子生物学方法,并参考其寄主、地理分布等信息(见附录A),判断其种类。6器材和试剂6.1仪器设备和器具PCR仪、冷藏箱、体视显微镜、生物显微镜、超低温冰箱、离心机、电泳仪、凝胶成像系统、高压灭菌1SN/T5394—2022学兔兔标准下载锅、微波炉、烘箱;漏斗、医用解剖刀、载玻片、盖玻片、酒精灯、线虫挑针、PCR管、24孔细胞培养板、可调式微量移液器(2μL~1000μL)及相应的吸头。6.2主要试剂除特别规定外,所有实验用试剂均为分析纯,实验用水应符合GB/T6682中相关规定。甲醛、乙醇、甘油、蜡块、指甲油、液氮、2×TaqMasterMix预混液、10×PCR缓冲液(Mg2+free)、蛋白酶K(20mg/mL)、限制性内切酶HinfI、ddH2O、100bpMarker、GelRed染料、50×TAE溶液、琼脂糖凝胶。7现场检疫与取样7.1症状检查现场检疫时应检查植株生长是否健康,选取生长不良、矮化、失绿、畸形等症状的植株,挖取少量根系,观察根上是否有根结或根瘤状畸形。7.2取样按照SN/T1157进行抽样和取样,对有根结等症状的重点取样。如无症状,则随机取样。对于进境苗木,如数量不大于5株,要求对每株单独取1份样品,每份样品质量不小于500g,取样深度为土表下20cm左右,要求多带些根。如数量大于5株,则要求取样5份以上。样品置密闭塑料袋中,标明品名、报检号、来源国、检测要求等信息,及时送实验室检测。如小苗带土较少,则尽量多取根和土样,不带土的苗应仔细检查根部。土壤、介质或其他植物产品可参照该方法。8实验室检验8.1线虫分离实验室接到样品后应立即进行线虫分离。若不能及时分离,可将样品暂时保存于4℃冷藏箱中。土壤、介质、根系等样品应用改良漏斗法分离线虫(按照GB/T24829),根结可直接剖检分离线虫(按照SN/T2117)。8.2体视显微镜镜检用改良漏斗法分离到的多数是根结线虫二龄幼虫,偶尔有雄虫。样品中根结线虫常与其他多种线虫混杂,须注意区分。根结线虫二龄幼虫较细小,体长多在300μm~500μm,行动迟缓,虫体一般内含物较多,颜色偏深。雄虫体长达1000μm~1500μm,行动迟缓。雌虫须剖开根结才能看到(但也有部分根结线虫不引起明显的结节,或根结部分露出根表面),呈球形或近梨形,长500μm~700μm,宽300μm~500μm,乳白色或褐色。8.3标本制作若镜检发现二龄幼虫或雄虫,需制作临时玻片或永久玻片(按照GB/T24829)。若发现雌虫,应制作会阴花纹永久玻片(按照SN/T2117)。8.4生物显微镜观察、拍照和测量仔细观察雌虫、雄虫和二龄幼虫主要鉴定特征并显微拍照,主要鉴定特征包括雌虫会阴花纹形态,2SN/T5394—2022学兔兔标准下载雌虫、雄虫和二龄幼虫的头部和口针形态,背食道腺开口到口针基球的距离(dorsalglandorifice,DGO),二龄幼虫的体长、口针长度及基部球形态、尾形及透明区长度等特征。应在每张图片上加相应标尺,测量并计算体长/虫体最宽处体宽(a)、体长/尾长(c)、尾长/肛门处体宽(c')等值。如样品足够,应测量雄虫、二龄幼虫各20条以上。9形态学鉴定9.1二龄幼虫形态特征(见附录C)体长约430μm(362μm~466μm),体纤细,环纹清晰。侧线4条。唇区略缢缩。口针纤细,基部球显著。中食道球卵圆形,瓣膜显著。尾圆锥形,肛宽约8.4μm(5.9μm~10.9μm),尾长约33μm(24μm~39μm),尾末端多数近尖,偶尔钝圆或不规则,透明尾长3.9μm~12.7μm,透明区附近体壁常有缢缩(测计值见表1)。9.2雌虫形态特征(参见附录D)虫体梨形或球形,颈部明显。肛门和阴门周围的表皮略高,导致会阴花纹和肛门、阴门不在焦平面上。会阴花纹卵圆形或扁卵圆形,线纹平滑细密。背弓和腹弓均低平。有些横纹从侧面伸向阴门的两端,尾端有环形线纹。侧尾腺口大,有1个明显的纹线向后弯跨侧尾腺口。侧尾腺间距为21.4μm±2.5μm(18.1μm~26.0μm),略大于阴门裂宽20.5μm±2.1μm(17.5μm~25.5μm),有时等宽。侧区有侧线1条~2条。阴门与侧尾腺的直线距离为25.8μm±1.9μm(23.0μm~28.6μm),阴门与肛门的距离为16.9μm±1.5μm(15.1μm~20.3μm)。9.3雄虫形态特征(见附录D)热杀死后虫体后端略腹弯。侧线4条。侧尾腺在肛门略后。口针粗壮,前端尖细,基部球圆。DGO为6μm~13μm。单精巢,长约800μm。交合刺稍向腹弯,末端钝圆。引带短,新月形。9.4与近似种的区别苹果根结线虫和杉并根结线虫M.suginamiensisToida&Yaegashi,1984最近似,两者雌虫会阴花纹均为细环纹,二龄幼虫尾较短。但前者会阴花纹轮廓近卵圆形,环纹平滑,后者会阴花纹轮廓近方形,且环纹呈波浪状;前者尾略长,31μm(30μm~34μm),尾末端一般锐尖,后者尾较短,25.2μm(20.8μm~27.3μm),且尾末端钝圆。苹果根结线虫会阴花纹与花生根结线虫M.arenaria(Neal,1889)Chitwood,1949相似,但花生根结线虫的阴门裂宽和侧尾腺间距平均值分别为32μm和30μm,显著大于苹果根结线虫。且苹果根结线虫的二龄幼虫平均尾长为31μm,显著短于花生根结线虫(58μm)。苹果根结线虫会阴花纹也与阿登根结线虫M.ardenensisSantos,1968相似,但后者阴门裂宽和侧尾腺间距平均值分别为26μm和29μm,显著大于苹果根结线虫。苹果根结线虫与山茶根结线虫M.camelliaeGolden,1979的区别是:前者雌虫会阴花纹为细环纹,后者为粗环纹;前者的二龄幼虫体长平均约420μm,尾长32μm,肛门处体宽8μm,后者分别为500μm、47μm和10μm。9.5形态测计值二龄幼虫是检测过程中常见的虫态,而雌虫和雄虫的测量数据对种类鉴定的作用有限,因此表1仅列出二龄幼虫的主要测计值。3SN/T5394—2022学兔兔苹果根结线虫二龄幼虫测计值及与原始文献和近似种山茶根结线虫比较表单位为纳米(μm)形态指标苹果根结线虫(顾建锋等,2013)苹果根结线虫(Itoh等,1969)苹果根结线虫(Palmisano等,2000)山茶根结线虫(王江岭等,2013)山茶根结线虫(Golden,1978)n2025302570体长425±30.1(362~466)418(390~450)413±20.6(373~460)512±26.4(462~560)501±21(443~576)最大体宽14.0±1.1(13.1~18.1)14.5(14~16)14.2±1.8(12.1~18.2)17.1±1.5(15.4~21.3)—口针长10.5±0.5(9.5~11.6)14(12~15)10.0±0.8(8.5~11.1)11.6±0.5(10.7~12.3)11.6±0.2(11.2~12)DGO4.4±0.57(3.5~5.5)4.7(4~6)3.6±0.4(3.0~4.8)3.9±0.6(3.1~5.2)3.7±0.4(3~4.5)尾长32.7±3.0(29.2~39.3)31(30~34)31.3±3.1(24.2~37.5)46.1±4.1(40.4~55.4)47±3.1(40~56)肛门处体宽7.9±0.9(5.9~9.6)8.5(7~9)8.4±1.0(7.3~10.9)10.8±0.9(9.6~12.7)—透明尾长7.2±2.3(3.9~9.3)—8.2±1.8(4.8~12.7)3.7±1.9(1.4~6.6)6.3±1.4(4~8.9)a30.4±2.6(25.2~34.5)28.5(27~31)29.5±3.4(22.3~35.5)30.1±2.9(22.6~33.8)26±1.8(21~30)c13.2±1.1(11.6~15.3)13.3(12~15)13.3±1.2(11.5~16.6)11.1±1.0(9.2~12.7)10.7±0.6(9.5~12)c'4.2±0.7(3.1~5.6)3.7(3~5)3.7±0.5(2.5~4.7)4.3±0.5(3.2~5.1)—10分子生物学鉴定10.1特异PCR鉴定方法采用苹果根结线虫特异引物MMF/MMR,进行特异PCR扩增,并同时采用通用引物D2A/D3B扩增核糖体rRNA的28S基因片段,消除因引物等问题而导致未扩增出片段造成的假阴性。以苹果根结线虫作为阳性对照,以其他线虫种类作为阴性对照,超纯水作空白对照。具体操作按照附录E执行。10.2mtDNA-RFLP方法mtDNA的COII/lrRNA基因片段扩增引物、程序参见JianhuaXu等,以苹果根结线虫作为阳性对照,超纯水作空白对照,PCR扩增产物采用限制性内切酶HinfI进行酶切。具体操作按照附录F执行。10.3DNA条形码方法采用引物D2A/D3B扩增28SrRNA基因。扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳检测后,送到生物测序4SN/T5394—2022学兔兔标准下载公司双向测序。获取的序列片段与NCBI中登录的苹果根结线虫和其他种类线虫的28SrRNA基因序列比对,通过序列相似性、系统发