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ICS65.020.20CCSB16中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T5554—2022玉米矮花叶病毒检疫鉴定方法DetectionandidentificationofMaizedwarfmosaicvirus2022-07-07发布2023-02-01实施中华人民共和国海关总署发布学兔兔—2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国上海海关、中华人民共和国哈尔滨海关、中华人民共和国长春海关、中华人民共和国湛江海关、浙江大学、中国农业科学研究院植物保护研究所。本文件主要起草人:于翠、田沂民、刘洪义、李海滨、龙阳、刘丽玲、吴建祥、刘忠梅、周雪平。ⅠSN/T5554—2022学兔兔、RT-PCR检测、免疫电镜及鉴别寄主测定等检测和鉴定方法。本文件适用于进出境及田间监管期禾本科植物材料包括种子、种苗及其蚜虫等传毒介体携带的玉米矮花叶病毒的检测和鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样方法3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4玉米矮花叶病毒基本信息中文名:玉米矮花叶病毒。英文名:Maizedwarfmosaicvirus。缩写:MDMV。分类地位:马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)病毒。MDMV的其他信息见附录A。5原理PCR仪、酶标仪、电子天平(1/1000g)、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、水浴锅、冷冻离心机、-80℃超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、微波炉、漩涡振荡器、球磨仪、电子透射显微镜。6仪器、设施、用具和试剂6.1仪器PCR仪、酶标仪、电子天平(1/1000g)、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、水浴锅、冷冻离心机、-80℃超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、微波炉、漩涡振荡器、球磨仪、电子透射显微镜。1SN/T5554—2022学兔兔设施隔离温室(10℃~30℃)。6.3用具可调式微量移液器(2μL、10μL、100μL、200μL、1000μL、5000μL)及相应的无RNA酶的吸头、无RNA酶的离心管、PCR管和研钵等。6.4试剂除有特殊说明外,所有实验用试剂均为分析纯。血清检测试剂盒、液氮、植物总RNA提取试剂盒、一步法RT-PCR检测试剂盒、琼脂糖、PBS缓冲液等。血清学和分子生物学试剂配制按照附录B和附录C执行。7抽样和待检样品制备7.1抽样抽样按照SN/T2122的规定执行。7.2待检样品制备7.2.1种子类样品若样品中存在畸形、不成熟的种子,则从中挑取出来单独作为一个样品进行检测;若无明显异常,则随机取适量种子,研磨仪研磨成粉后,按照1∶10(质量:体积)加入抽提缓冲液(符合B.1.5)混合均匀,3000g低速离心取100μL上清液用于DAS-ELISA或核酸检测,或取约0.1g干粉样品直接提取RNA。7.2.2种苗类样品对于有症状的种苗类样品单独检测,重点选取表现症状的幼嫩叶片;无症状样品至少选取20株的幼嫩叶片进行混样检测。样品研磨后按照1∶10(质量:体积)加入提取缓冲液混合均匀,制备的汁液分别盛装于1.5mL离心管中,3000g低速离心后吸取上清液用于DAS-ELISA或核酸检测,或直接将叶片利用液氮进行研磨,取约0.1g干粉样品直接提取RNA。8检测与鉴定8.1检测鉴定流程检测流程见图1,在检测过程中应设置合适的对照。当首次检出或某一地区首次发生时,应在分子检测结果的基础上,进一步采用其他方法进行验证。2SN/T5554—2022学兔兔双抗体酶联免疫吸附测定方法(DAS-ELISA)取7.2中制备的待检样品用于血清学检测。试验设置2个阳性对照孔、2个阴性对照孔、2个空白对照孔作为质量控制,并根据送检样品数量设置待检测样品孔数,要求每个待测样品至少设2次重复。具体检测步骤按照附录B执行。8.3RT-PCR检测取7.2中制备的待检样品上清液100μL或0.1g粉末用于植物总RNA提取并进行RT-PCR检测。试验用健康的植物组织作阴性对照,用受MDMV侵染的植物样品作阳性对照,用灭菌双蒸水作空白对照,每个反应体系设置两个平行。具体操作按照附录C执行。8.4免疫电镜免疫电镜检测按照SN/T1840中的方法进行观察。3SN/T5554—2022学兔兔鉴别寄主测定在室温(20℃~25℃)条件下,栽种于隔离检疫温室中的玉米(Zeamays)、高粱[Sorghumbicolor(L.)Moench]、假高粱(Sorghumhalepense)等鉴别寄主植物真叶长出后可作为指示植物用于摩擦接种。对经DAS-ELISA或RT-PCR检测阳性的植株或种子,加入适量接种缓冲液研磨后接种指示植物。接种7d~10d后,根据寄主植物产生的症状,判定是否接种成功。具体操作见附录D。9结果判定样品检测时,检测流程及结果判定按下述原则进行。———RT-PCR初步筛检,若检测结果为阴性,则判定样品不携带MDMV;若一对引物检测结果为阳性,则采用产物序列测定分析或另一对引物再次检测,若验证结果为阳性,则判定样品携带MDMV;若验证结果为阴性,则判定样品不携带MDMV。———ELISA检测仅用于有明显症状的植株样品,若ELISA检测结果阳性,则还需RT-PCR进行复验,若验证结果阳性,则判定样品携带MDMV;若验证结果为阴性,则判定样品不携带MD-MV。10样品与记录结果保存10.1经检测确定携带玉米矮花叶病毒的样品应保存在适合的条件下以备复核。如种子保存在干燥条件下,其他病叶等样品保存在-20℃冰箱中,有条件的保存在-80℃冰箱中。做好登记和标记工作。10.2记录包括:样品来源,种类,取样人员,实验的时间、地点、方法和结果,检验检疫员的签字等。酶联免疫吸附测定法检测应有酶联板反应的光密度OD值,生物学测定应有鉴别寄主的症状照片,RT-PCR检测应有电泳结果照片及序列测定分析数据4SN/T5554—2022学兔兔(资料性)玉米矮化叶病毒其他相关资料A.1寄主范围MDMV的寄主仅限于禾本科植物,包括玉米、甜玉米(Zeamayssubsp.mays)、高粱、假高粱、燕麦(Avenasativa)、扁穗雀麦(Bromuscatharticus)、孟仁草(Chlorisbarbata)、两耳草(Paspalumcon-jugatum)、御谷(Pennisetumglaucum)、甘蔗(Saccharumofficinarum)、苏丹草(Sorghumsudanense)、侧钝叶草(Stenotaphrumsecundatum)、摩擦禾(Tripsacumdactyloides)、臂行草属(Urochloaplantag-inea)、黍(Panicummiliaceum)、粟[Setariaitalicavar.germanica(Mill.)Schred]、狗尾草[Setariaviridis(L.)Beauv.]等15种禾本科作物及杂草,而试验寄主则多达290多种,其中假高粱是MDMV田间永久毒源。A.2为害症状玉米矮花叶病是玉米上发生严重的一种病害,受害植株雄穗不发达,分枝减少甚至退化,果穗变小,秃顶严重,有的不结实。MDMV在玉米和高粱上引起的症状相似,受病毒侵染的植株表现为褪色、矮化、不育,有时提早枯死,症状严重度主要取决于品种的感病性及侵染时间的早晚,早期侵染导致严重及更明显的症状。普通玉米常比甜玉米及玉米自交系症状要轻。花叶通常出现在尚处于叶鞘中而未展开的心叶基部,先是在主脉两侧出现褪绿斑点和条斑,然后整个成长叶片布满病斑,条斑和条点相连形成沿叶脉扩展的褪绿条纹或线条,感染后新长出的叶片变为褪绿和黄化(见图A.1)。图A.1MDMV侵染玉米的症状(引自CABI)A.3分布地区MDMV在欧洲、美洲、非洲和澳大利亚等玉米产地均有分布。近年来研究者的鉴定结果表明发生5SN/T5554—2022学兔兔标准下载于中国的玉米矮花叶病害的病原为甘蔗花叶病毒,而不是玉米矮花叶病毒。欧洲:捷克、克罗地亚、俄罗斯、德国、希腊、法国、匈牙利、意大利、西班牙、乌克兰、罗马尼亚、塞尔维亚和黑山。美洲:加拿大、美国、墨西哥、古巴、洪都拉斯、海地、阿根廷、巴西、智利、秘鲁、委内瑞拉、哥伦比亚。亚洲:中国、格鲁吉亚、伊朗、伊拉克、韩国、哈萨克斯坦、土耳其、菲律宾、巴基斯坦、乌兹别克斯坦。非洲:埃及、尼日尔、尼日利亚、津巴布韦、南非、摩洛哥、埃塞俄比亚、肯尼亚、喀麦隆、摩洛哥、赞比亚、毛里求斯。大洋洲:澳大利亚。A.4传播方式超过20种蚜虫能够以非持久性方式传播MDMV。能够传毒的蚜虫种类包括玉米蚜[Rhopalosi-phummaidis(Fitch)]、桃蚜[Myzuspersicae(Sulzer)]、禾缢管蚜[Rhopalosiphumpadi(Linnae-us)]、早熟禾缢管蚜[Rhopalosiphumpoae(Gill.)]、甘蓝蚜[Brevicorynebrassicae(Linnaeus)]和苹果缢管蚜[Rhopalosiphumfitchii(Sand.)]等。蚜虫获MDMV时间10s~30s,持毒时间一般为30min~240min,但少数蚜虫的持毒时间可超过19h,使得MDMV能长距离传播。增加获毒时间,可延长持毒时间,蚜虫的不同生物型在传毒效率上也不同。病毒浓度和病株组织的老、嫩会影响蚜虫的传播。MDMV发生高峰与蚜虫介体大量迁飞相一致。蚜虫迁飞发生于5月~7月,有时甚至到8月。此外已证明MDMV还能由锈菌(Pucciniasorghi)的夏孢子传播。除蚜虫和锈菌夏孢子传播外,MDMV也可经种子传播。由带毒玉米种子长出玉米矮花叶病的植株的概率约为0.5%,而带毒率则因玉米品种不同而有变化。对种子不同成熟阶段进行解剖分析确认病毒的存在部位,发现传粉21d后,种皮都能检出MDMV,而胚或胚乳则只偶尔能检出MDMV。病毒不能侵染胚意味着病毒传给下一代的机率大大降低。MDMV汁液接种传播。A.5病毒粒体和基因组特征MDMV病毒粒子弯曲线状,大小约为750nm×14nm(见图A.2),沉降系数为165S~175S,MD-MV病毒粒体中核酸占5%~6%,蛋白占94%~95%,基因组为单链正义RNA(ssRNA),约9500bp,外壳蛋白分子量约30kDa。病毒侵染后在植物细胞内产生风轮状及卷筒状内含体。图A.2粗提纯的玉米矮花叶病毒粒体(2%磷钨酸负染色)6SN/T5554—2022学兔兔与玉米矮花叶病害相关的其他病毒玉米矮花叶病又名花叶条纹病、花叶病毒病、黄绿条纹病,是世界上玉米产区普遍发生的病毒病害之一,玉米矮花叶病的发生流行严重影响了玉米生产,约翰逊草花叶病毒(Johnsongrassmosaicvirus,JGMV)、玉米矮花叶病毒(Maizedwarfmosaicvirus,MDMV)、甘蔗花叶病毒(sugarcanemosa-icvirus,SCMV)和高粱花叶病毒(sorghummosaicvirus,SrMV)4种不同的病毒都能引起玉米矮化花叶症状。4种