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ICS65.020.20CCSB16中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T5536—2022较小根结线虫检疫鉴定方法DetectionandidentificationofMeloidogyneminorKarssen,Bolk,v.Aelst,v.d.Beld,Kox,Korthals,Molendijk,Zijlstra,v.Hoof&Cook,20042022-07-07发布2023-02-01实施中华人民共和国海关总署发布学兔兔—2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国拱北海关、临沂科技职业学院、中华人民共和国青岛海关。本文件主要起草人:迟远丽、林伟、水克娟、廖佳、权永兵、黄永辉、廖力、张卫东、徐淼锋、封立平。ⅠSN/T5536—2022学兔兔范围本文件规定了出入境植物检疫中较小根结线虫的检疫鉴定方法。本文件适用于出入境植物及其繁殖材料、土壤及栽培介质中较小根结线虫的检疫鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T1157进出境植物苗木检疫规程SN/T1158进出境植物盆景检疫规程SN/T2117—2008伪哥伦比亚根结线虫检疫鉴定方法SN/T4643线虫标本采集分离保存规范SN/T4723—2016根结线虫属(非中国种)检疫鉴定方法3术语、定义和缩略语3.1术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。3.2缩略语下列缩略语适用于本文件。本文件没有需要界定的术语和定义。下列缩略语和符号仅适用于本文件。n—测计的标本数;L—体长;W—虫体宽(最大体宽);HH—头区高度;HW—头区宽度;ST—口针长度;STKH—口针基部球高度;STKW—口针基部球宽度;DGO—背食道腺开口到口针基部球的距离;Tail—尾长;Hyalinetailterminus—透明尾长;a—体长/最大体宽;c—体长/尾长。1SN/T5536—2022学兔兔基本信息中文名称:较小根结线虫。学名:MeloidogyneminorKarssen,Bolk,v.Aelst,v.d.Beld,Kox,Korthals,Molendijk,Zijlstra,v.Hoof&Cook,2004。分类地位:线虫门(Nematoda),色矛纲(Chromadorea),小杆目(Rhabditida),垫刃亚目(Tylenchi-na),垫刃总科(Tylenchoidea),根结科(Meloidogynidae),根结亚科(Meloidogyninae),根结属(Meloid-ogyne)。较小根结线虫是重要的植物根系内专性寄生线虫,主要通过带根植物及其相关产品、土壤及栽培介质传播扩散,成熟雌、雄虫、二龄幼虫形态,会阴花纹特征等是较小根结线虫检验鉴定的主要依据,寄主范围、地理分布等信息可供参考。其他信息见附录A。5方法原理将送检的样品进行线虫分离,雌虫可从根结直接剥离获得,雄虫和二龄幼虫可采用贝曼漏斗法或浅盘法从土壤或剪碎的植物根部分离得到。分离得到的成熟雌虫,雄虫和二龄幼虫,制成临时玻片或永久玻片,在生物显微镜下观察线虫形态并进行测量和拍照等工作。根据形态特征和形态测计值进行线虫的检疫鉴定。6仪器、用具和试剂6.1仪器生物显微镜(具测微尺和拍照功能)、体视显微镜(具透射光源)、恒温培养箱、冰箱、离心机、PCR仪、荧光PCR仪。6.2用具培养皿、盖玻片、载玻片、挑针、酒精灯、线虫滤纸或纱布、离心管、贝曼漏斗分离器、乳胶管、止水夹、加热板、水桶、标准套筛(40目~500目)、移液器、干燥器、记号笔。6.3试剂4%甲醛、甘油、指甲油、石蜡、DESS溶液(配制方法见SN/T4643)、PCR缓冲液、DNA聚合酶。7现场检疫首先观察苗木的生长状况,有无发育不良、黄化、萎蔫、变色等症状,然后对植物或种苗的根、茎根、根状茎等地下部分进行检查,重点选取根部组织皮层增厚、肿大,形成根结,或块根、块茎的皮层有很多小的褐色坏死组织的苗木及根际介质或土壤,如无可疑症状则按要求随机取样。取样后立即置于密封塑料袋内,标记后及时送实验室检验。具体抽样比例按SN/T1157和SN/T1158执行。2SN/T5536—2022学兔兔线虫分离在体视显微镜下能观察到有根结或是瘤状突起的植物组织,可采用直接解剖法将线虫剥离到培养皿中;土壤和其他介质中的二龄幼虫和雄虫采用贝曼漏斗法进行线虫分离(具体操作见SN/T2117—2008中7.1)。8.2显微镜镜检分离获得的线虫悬浮液在体视显微镜下进行初检,初步观察线虫的形态结构,挑取疑似较小根结线虫的二龄幼虫和雄虫直接做成临时玻片或永久玻片,成熟雌虫需制作会阴花纹的临时玻片或永久玻片,在生物显微镜下进行形态观察、测量和拍照。玻片制作参见SN/T2117—2008的附录C。8.3生物显微镜观察、拍照和测量将制作的线虫玻片置于生物显微镜下,观察线虫的形态特征,并对会阴花纹形态、头部及尾部形态等进行拍照,测量各形态特征值。9形态鉴定特征及形态测计值9.1根结属线虫(MeloidogyneGoeldi,1892)的主要鉴别特征成熟雌虫虫体膨大呈梨形或球形,具突出的颈,头架弱,口针细,长度一般为10μm~25μm,排泄孔位于中食道球前水平处,双卵巢,阴门和肛门位于虫体末端的会阴区,无尾。会阴区有指纹状花纹。雄虫蠕虫形,体细长,头架和口针强壮,食道峡部粗短,尾短,无交合伞,交合刺粗壮。二龄幼虫蠕虫形,头架和口针细弱,具透明尾或不明显。9.2较小根结线虫(M.minor)形态特征9.2.1成熟雌虫形态特征虫体相对较小,白色,呈圆形或长圆形;体表环纹浅,颈区明显,通常弯曲;头帽明显且形状多变,唇盘高,侧唇突出,头架轻微硬化;口针略向背侧弯曲,基部球为横卵圆形,向后倾斜;排泄孔位于口针基部球附近;会阴花纹小而圆,线纹细,背弓低且线纹粗糙,有的会阴花纹有细弱的侧线;侧尾腺小,通常不明显,位于肛门前面。成熟雌虫形态特征参见附录B图B.1、附录C图C.1、附录D图D.1。9.2.2成熟雄虫形态特征虫体蠕虫状,具体环,侧区有4条侧线;头部不缢缩,唇盘圆形,突起,并与锚状亚中唇融合;亚中唇区靠近唇盘处有4个小的缝状头感器,开口位于唇盘与侧唇之间;头架高度硬化,口针基部球横卵圆形,从针杆部向后倾斜。背食道腺开口位于口针基部球附近;食道腺细长,腹覆盖肠,有两个食道腺核。中食道球椭圆形,半月体长3.5μm~4.5μm,位于排泄孔前面;尾部通常向腹面弯曲,短小,圆锥形,末端钝圆;交合刺和引带细长,向腹面弯曲,侧尾器小,位于泄殖腔附近。成熟雄虫形态特征参见附录B图B.1、附录C图C.2、附录D图D.2。3SN/T5536—2022学兔兔二龄幼虫形态特征已知种群二龄幼虫的虫体较小,体长310μm~416μm,蠕虫形,具环纹;侧线4条,网状结构不明显。头部圆,不缢缩,头架较弱,口针较小,口针基部球横卵圆形,略向后倾斜;尾长49μm~63μm,渐变细,有时向腹面弯曲,透明尾相对较长12.0μm~22.1μm,尾端钝圆。二龄幼虫形态特征参见附录B图B.1和附录C图C.3。9.3形态测计值较小根结线虫形态测计值见表1。表1较小根结线虫形态测计值形态指标测计值n(条)25♀♀25♂♂二龄幼虫(25)L/μm526±71(416-608)1045±54(790-1488)377±8(310-416)W/μm339±55(240-464)26.9±0.4(21.5-31.6)13.3±1.3(12.0-15.8)HH/μm—3.9±0.7(3.2-4.4)2.0±0.2(1.9-2.5)HW/μm—9.6±0.9(8.9-10.7)5.2±0.4(5.1-5.7)a1.6±0.3(1.1-2.3)39.0±4.2(29.8-48.3)28.4±2.0(23.9-32.4)c—101±21.3(72.4-140)7.0±0.3(6.2-7.6)ST/μm14.2±1.1(12.6-15.2)17.8±1.0(17.1-19.0)9.2±0.9(7.6-10.1)STKH/μm1.7±0.5(1.3-1.9)2.0±0.3(1.9-2.5)1.3±0.2(1.2-1.4)STKW/μm3.5±0.5(3.2-3.8)4.2±0.5(3.8-5.1)1.9±0.3(1.8-2.0)DGO/μm4.1±1.2(3.2-6.3)3.8±0.4(3.2-4.4)3.0±0.5(2.5-3.2)Tail/μm—10.5±2.3(8.2-12.6)54±6.2(49-63)Hyalinetailterminus/μm——16.1±3.9(12.0-22.1)以上形态测计值引自KarssenG等(2004),—表示空白。9.4较小根结线虫与近似种的区别较小根结线虫与奇氏根结线虫(M.chitwoodi)和小突根结线虫(M.microtyla)在形态上容易混淆,主要区别见表2。表2较小根结线虫与奇氏根结线虫、小突根结线虫的主要形态区别形态特征较小根结线虫奇氏根结线虫小突根结线虫雌虫口针基部球形状横卵圆形小,圆形到不规则形明显的圆形基部球会阴花纹小而圆,侧线明显,背弓通常低圆至卵圆形,侧线不明显无侧线,大多数背弓中等4SN/T5536—2022学兔兔较小根结线虫与奇氏根结线虫、小突根结线虫的主要形态区别(续)形态特征较小根结线虫奇氏根结线虫小突根结线虫雄虫头部头部不缢缩,头冠非常高、圆头部不缢缩,头帽圆,唇盘不高头区与虫体分离,头架明显二龄幼虫口针口针长7.6μm~10.1μm,基部球大口针长9.0μm~10.3μm口针纤细,长11μm~12μm,有小的基部球二龄幼虫尾部尾长49μm~63μm,透明尾长12.0μm~22.1μm,末端变窄,尾尖细圆尾长33μm~49μm,透明尾长9μm~12μm,前端有明显的界限,尾端钝圆尾长40μm~48μm,透明尾长9μm~10μm,末端圆以上奇氏根结线虫数据引自Golden等(1980),小突根结线虫数据引自Mulvey等(1975)。10较小根结线虫分子鉴定方法如通过形态鉴定方法仍不确定是否为较小根结线虫时,可采用DNA条形码鉴定方法和实时荧光PCR方法加以验证,具体操作步骤参见附录E。11结果判定主要以成熟雌虫、雄虫和二龄幼虫的形态特征及形态测计值作为较小根结线虫鉴定的依据,符合9.2形态鉴定特征及9.3形态测计值的线虫可判定为较小根结线虫。分子鉴定方法可作为形态鉴定方法的补充和验证,DNA条形码方法的序列比对结果与NCBI中登录的序列号[KX671113.1]的较小根结线虫同源性高于99%,且幼虫的特异性实时荧光PCR结果与较小根结线虫吻合,则判定为较小根结线虫。12样品保存若鉴定为较小根结线虫,则将剩余的线虫杀死、固定制成永久玻片保存;也可以用4%甲醛固定后长期保存或线虫DESS溶液长期保存,具体保存方法参照SN/T4643。应保存的记录信息包括样品编号、为害症状(包括相关照片)、被感染材料的状态和来源、经鉴定的有害生物的学名、测计数据、显微照片、标本鉴定人、鉴定时间、制作人、制作时间等信息。对含有线虫的剩余样品材料,经记录后妥善保存。保存期至少为6个月。期满后视情况作销毁处理。5SN/T5536—2022学兔兔(资料性)较小根结线虫基本信息A.1寄主范围自然寄主:匍匐剪股颖(Agrostissto