搜索
ICS65.020.20CCSB16中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T5546—2022欧洲樱桃绕实蝇检疫鉴定方法DetectionandidentificationofRhagoletiscerasi(Linnaeus)2022-07-07发布2023-02-01实施中华人民共和国海关总署发布学兔兔—2022*中国海关出版社有限公司出版发行北京市朝阳区东四环南路甲1号(100023)编辑部:(010)65194242-7530网址中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本880×12301/16印张1.25字数38千字2023年1月第一版2023年1月第一次印刷印数1—500*书号:155175·916定价21.00元学兔兔—2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国满洲里海关、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国广州海关、中华人民共和国二连海关、中华人民共和国呼和浩特海关。本文件主要起草人:刘玮琦、陈超、姜帆、梁帆、张永宏、郑敏、耿俊东、杨东来、邢磊、刘文敏、王旭、陈树华。ⅠSN/T5546—2022学兔兔(Linnaeus,1758)的检疫鉴定方法。本文件适用于植物及植物产品中欧洲樱桃绕实蝇的检疫和鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T1883苹果实蝇检疫鉴定方法SN/T1847寡毛实蝇类害虫分类学术语3术语和定义SN/T1383和SN/T1847界定的术语和定义适用于本文件。4欧洲樱桃绕实蝇基本信息学名:Rhagoletiscerasi(Linnaeus,1758)。异名:Muscacerasi(Linnaeus,1758),Rhagoletisfasciata(Rohdendorf,1961),Rhagoletisnig-ripes(Rohdendorf,1961),Rhagoletisobsoleta(Hering,1936),Tephritisceraci(Persson,1958),Trypetasignata(Meigen,1826),Urophoracerasorum(Dufour,1845),Urophoraliturata(Robineau-Desvoidy,1830)。英文名:Europeancherryfruitfly,cherryfruitfly,cherrymaggot。其他中文名称:欧洲樱桃实蝇,樱桃绕实蝇。分类地位:双翅目Diptera,实蝇科Tephritidae,绕实蝇属Rhagoletis。传播途径:成虫具有一定的飞行能力,可进行近距离传播。成虫、幼虫、卵随寄主果实和运输工具远距离传播,老熟幼虫、蛹可随土壤、介质等进行远距离传播。欧洲樱桃绕实蝇的其他信息参见附录A。5方法原理根据欧洲樱桃绕实蝇的为害状,在检疫现场发现疑似欧洲樱桃绕实蝇为害的果实,获取卵、幼虫、蛹或成虫等样本,卵、幼虫或蛹须饲养至成虫后制作成针插标本,置于体视显微镜下观察,依据成虫的形态特征对种类进行鉴定。也可利用欧洲樱桃绕实蝇特异性扩增引物的常规PCR检测方法和实时荧光PCR检测方法,对欧洲樱桃绕实蝇进行种类判定。1SN/T5546—2022学兔兔器材可封口塑料袋、标签、培养皿、吸水纸、镊子、小毛笔、指形管、纱布、冰箱、三角纸、剪刀、昆虫针、滴管、培养皿、载玻片、盖玻片、体视显微镜、荧光定量PCR仪、PCR仪、冷冻混合球磨仪、超净工作台、电泳仪、凝胶成像分析仪、核酸蛋白检测仪、微量组织捣碎仪、高速冷冻离心机、研磨机、台式小型离心机、制冰机、旋涡震荡器、移液器、电子天平、pH计、水浴锅、生物培养箱、纯水仪、高压灭菌器、超低温冰箱等。6.2试剂醋酸钾、双蒸馏水、液氮、蛋白酶K(20mg/mL)、RNA消化酶、Tris饱和酚、PremixExTaq(2×)、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、75%乙醇、95%乙醇、100%乙醇、10×PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、Taq酶、DNAMarker、琼脂糖、GoldView型核酸染色剂(5000×)、引物探针、昆虫基因组DNA提取试剂盒、白砂糖、啤酒酵母、苯酚、氢氧化钠(钾)等。提取液A:1%SDS,50mmol/LTris·Cl(pH8.0),25mmol/LNaCl,25mmol/LEDTA(pH8.0)。7现场检疫仔细检查果实表面有无产卵痕迹,或果实是否有腐软的现象,剖果检查是否有蛆状幼虫。将染虫果或者怀疑带虫的果实进行培养观察。欧洲樱桃绕实蝇为害状参见附录B。8实验室鉴定8.1形态学鉴定8.1.1饲养8.1.1.1卵或幼虫的饲养将现场采取的卵或幼虫部分个体制成鉴定标本,其余个体继续用原寄主果实培养。具体的培养方法是:将带有卵或幼虫的寄主果实放在小号白瓷盘里,然后将小号白瓷盘放在装有自来水的大号白瓷盘内,再用防虫网罩住小号白瓷盘,罩的下方边缘浸没于大号白瓷盆内的水中。置于温度为20℃~25℃,湿度为30%~60%的生物培养箱中饲养至幼虫老熟。8.1.1.2蛹的饲养取一盛有洁净细砂的养虫杯(沙子厚度10cm,含水量5%~10%),将现场检疫收集的或室内培养得到的围蛹埋于距细砂表面3cm~5cm处(若是老熟幼虫则可直接将其置于细砂表面,幼虫将钻入沙中化蛹)。将养虫杯放置于5℃以下的冰箱中冷藏180d左右,取出养虫杯置于温度为22℃~25℃,湿度为30%~60%的生物培养箱中饲养,直至成虫羽化。8.1.1.3成虫的饲养成虫羽化后,悬挂相应寄主果实切片于养虫箱内供其取食;或将白砂糖和啤酒酵母按照1∶2质量比混合制成饲料放入小容器中喂养,此外,在培养皿中放入几张滤纸,加适量的水浸透滤纸供成虫饮用。2SN/T5546—2022学兔兔标准下载待成虫斑纹的色泽和大小稳定(约3d~5d)后,收集成虫并置于冰箱冷冻层(约-20℃)0.5h~1h,杀死,待鉴定。8.1.2标本的预处理8.1.2.1成虫还软处理如果成虫虫体已干硬,在制作标本前应进行还软处理。具体方法是:取一小型干燥器,加入干净细砂约2cm,加水至漫过细砂表面约1cm,并滴加数滴苯酚以防标本腐烂,上层放待还软的成虫标本,密封室温放置。8.1.2.2成虫标本制备借助三级台将昆虫针插入三角纸尖角近处,然后将针尖端从成虫中胸的腹面插入,再用昆虫针插入三角纸另两个角中央近边缘处,固定,插上相应的标签。8.1.2.3幼虫封片标本制备用昆虫针在幼虫体壁上刺戳数个小孔,置于10%氢氧化钠(或10%氢氧化钾)溶液中浸泡12h(或煮沸3min)后取出,用解剖针将幼虫体中的残留物挤压出并用蒸馏水洗净:在体视显微镜下挑取口钩、前气门和后气门等部位,置于载玻片上,滴上封片胶,用解剖针将所挑取部位展开,盖上盖玻片并附上相应的标签。8.1.3绕实蝇属Rhagoletis形态特征成虫颊高通常不及复眼高的1/4,具下额眶鬃3对~4对,上额眶鬃2对,单眼鬃发达,其长短和粗细与上额眶鬃相当。触角第3节末端常呈角状突起(部分种类端圆)。中胸背板常具4条棉毛纵带并与黑色到暗褐色的背板相映;背中鬃的位置较前,约在前翅上鬃连线上或其稍后处。中胸背板具缝前背侧鬃,小盾鬃2对。翅cup室宽,其宽明显超过bm室的一半,且通常与bm室宽近等。径中(R-M)横脉位于接近dm翅室的中点处。cup室后端角延长段短,其长不超过A1+CuA2脉长的1/5。CuA2脉段直。M1+2脉在到达翅缘前不上拱,与翅缘相交成角。翅基区无网状斑纹。腹部第2~4节腹背板(雄成虫)或第2~5节腹背板(雌成虫)大多具淡黄色到白色的基横带。8.1.4欧洲樱桃绕实蝇形态特征8.1.4.1成虫(参见附录C)———成虫以黑色或黑褐色为主(图C.1)。———雌虫体长5.0mm~6.2mm左右,雄虫体长4.0mm~4.5mm左右。———上侧额鬃2对,下侧额鬃3对。单眼鬃发达,与下侧额鬃近等长(图C.2)。———触角显短于颜,末端呈角状突起。———中胸背板黑色,具4条分离的灰色纵纹(图C.3)。———前翅上鬃存在,背中鬃位于前翅上鬃连线上或其稍后处。———后小盾片黑褐色,中背片全黑褐色。———小盾片较平坦,黄色,基部两侧具黑色斑,小盾鬃2对(图C.3)。———各足腿节具暗褐色。———翅具黄褐色带纹;中横带伸达翅的后缘,不与端前横带相连;端前横带和前端横带相连;具副前3SN/T5546—2022学兔兔标准下载缘横带(图C.4)。———翅M脉端段直;臀室(cup室)与基中室(bm室)宽近等,cup室后端角延伸段短,其长显短于臀脉与肘脉的合并脉(A1+CuA2)段长;CuA2脉突然前倾。———雌虫腹部背板黑褐色,不具浅黄色基横带(图C.5)。雄虫腹部背板具浅黄色基横带,第5腹节腹板后缘深凹(图C.6)。———产卵器基节长是第5腹节背板长的0.75倍;产卵管末端针状,不具齿,长0.7mm~0.8mm;具3个骨化的受精囊。8.1.4.2卵(参见附录C)———卵粒大约长0.75mm,宽0.25mm(图C.7)。———长椭圆形,乳白色。8.1.4.3幼虫(参见附录C)———3龄幼虫体长4.5mm~6.0mm,宽1.5mm~2.0mm,蛆形,白色至黄色(图C.8)。———口感器圆形,有2个小感器。———口钩黑色,高度骨化,1~3龄幼虫口钩端部均具端前齿(图C.9)。———第8腹节中间叶甚发达。———胸部前气门扇形(图C.10),前缘指突12~15个,单排(图C.11);后气门位于中线上方(图C.12),气门裂长是宽的4~5倍,有骨化缘(图C.13)。———肛叶大,突起,前有一不连续的小刺列,在肛开口下方有小刺群(图C.14)。8.1.4.4蛹(参见附录C)———围蛹,淡黄色,圆柱形(图C.15)。———长3.0mm~4.0mm,宽1.5mm~2.0mm(图C.16)。———蛹体上残留有由幼虫前气门突起而成的暗点,后端后气门处稍收缩。8.1.5与近似种的鉴别绕实蝇属已知共约68种,本标准描述了其中最具经济重要意义的种类17种。欧洲樱桃绕实蝇与近似种的分类检索表参见附录D。8.2分子生物学鉴定8.2.1实蝇基因组DNA提取取实蝇样本(成虫、卵、幼虫、虫蛹或部分组织等)于双蒸水中漂洗数次,吸水纸吸干,体视显微镜下剔除其表面的附着物,虫蛹去掉蛹壳。置于1.5mL离心管中,加入40μL提取液A,放置于-70℃冰箱中,20min后取出,用灭菌牙签或微量组织捣碎仪捣碎,匀浆,加入等体积的3mmol/L醋酸钾(pH7.2),冰上放置1h,加入等体积酚和三氯甲烷,混匀,12000g离心10min,取上清液,加入2倍体积冰冻100%乙醇混匀,放置冰箱1h沉淀DNA,12000g离心15min,弃上清液,加入1mL75%乙醇洗涤沉淀,12000g离心1min,晒干乙醇后用100μL双蒸水溶解沉淀,用核酸蛋白检测仪测定DNA浓度和纯度后,将提取的基因组DNA于-20℃保存备用;也可采用试剂盒方法提取基因组DNA。8.2.2DNA质量检查用核酸蛋白检测仪测定DNA的纯度与浓度,分别取得260nm和280nm处的吸光值,核酸的纯度4SN/T5546—2022学兔兔标准下载和浓度计算式见式(1)、式(2)。DNA纯度=OD260/OD280…………………………(1