SNT 5368.1-2022 商品化试剂盒检测方法 克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌) 方法一

ICS07.100.30CCSX04中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T5368.1—2022商品化试剂盒检测方法克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)方法一CommercialKitDetectionMethod-Cronobacterspp.(Enterobactersakazakii)—TestmethodⅠ2022-03-14发布2022-10-01实施中华人民共和国海关总署发布前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件是SN/T5368《商品化试剂盒检测方法克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)》的第1部分。SN/T5368已经发布了以下部分:———商品化试剂盒检测方法克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)方法一。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中国海关科学技术研究中心、中华人民共和国石家庄海关、中华人民共和国福州海关、中华人民共和国拱北海关、中华人民共和国深圳海关。本文件主要起草人:曾静、张西萌、张琳、徐蕾蕊、马丹、郑晶、冯家望、吕敬章。ⅠSN/T5368.1—2022商品化试剂盒检测方法克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)方法一1范围本文件规定了食品中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的环介导恒温核酸扩增(loop-mediatedisother-malamplification,LAMP)检测方法。本文件适用于食品中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB4789.40食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测SN/T2775商品化食品检测试剂盒评价方法SN/T3266食品微生物检验方法确认技术规范3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4生物安全措施为了保护实验室人员的安全和防止污染,应由具备资格的工作人员检测克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)。所有培养物、DNA提取物和废弃物应按照GB19489和GB/T27403中的有关规定执行。5技术概要应用环介导恒温核酸扩增(LAMP)技术进行克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的筛选检测。根据克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)特有靶序列上的6个独立区域,采用6条特异引物通过稳定的BstDNA聚合酶来驱动扩增反应,在60℃左右完成恒温扩增。在环介导恒温核酸扩增反应中,焦磷酸盐(PPi)通过ATP-硫酸化酶被转化成三磷酸腺苷(ATP)。荧光素酶利用ATP发光,实现实时检测。6试剂与材料6.13MMDS克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)分子检测试剂盒,本试剂盒参考SN/T2775和SN/T3266由国家认证认可监督管理委员会商品化食品检测试剂盒评价专家委员会组织评价。具体评价结果参见1SN/T5368.1—2022附录A。试剂盒组成如下:a)裂解溶液(透明管中的粉红溶液LS管);b)扩增试剂管(含有冻干试剂小球,橙红色试管);c)阳性对照(RC);d)盖子(橙红色盖)。注:如商品化试剂盒关键技术指标发生变动时,以试剂盒说明书操作为准。6.2克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)质控菌株:ATCC29544。6.3缓冲蛋白胨水(BPW)培养基:按照附录B。6.43%84消毒液。7仪器和设备除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:a)恒温培养箱:36℃±1℃;b)天平:感量0.1g;c)无菌锥形瓶:2000mL;d)移液器:量程10μL~100μL;e)加热模块:100℃±1℃;f)3M分子检测仪;g)计时器。8检测程序食品中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)LAMP检测程序见图1。2SN/T5368.1—2022图1食品中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)LAMP检测程序9操作步骤9.1样品制备、增菌培养以无菌操作取样品100g(mL)置灭菌锥形瓶中,加入900mL预热至44℃的BPW培养基中,用手缓缓地摇动至充分溶解,在36℃±1℃条件下培养18h±2h。9.2细菌模板DNA的制备(裂解)9.2.1将裂解溶液(LS)管的温度平衡到室温,混合均匀。9.2.2用移液器从8.1获得的BPW增菌液吸取20μL转移到LS裂解管内。9.2.3当3M分子检测加热模块的温度达到100℃±1℃时,将无盖LS管架放在加热模块中加热15min±1min,LS将从粉红(冷)变为黄色(热)。9.2.4从加热模块中取出LS管架,将其放在冷却架冷却5min~10min至LS恢复为粉红色。9.3环介导恒温核酸扩增(LAMP)反应9.3.1阴性对照、阳性对照设置每次反应必须设置阴性对照和阳性对照。阴性对照以无菌增菌培养基(BPW)替代DNA模板,请勿将水用作阴性对照。阳性对照为试剂盒提供的RC。3SN/T5368.1—20229.3.2扩增过程9.3.2.1吸取LS管中DNA模板20μL,至扩增试剂管(含有冻干试剂小球),成一定角度缓慢加入,以避免搅动小球,轻轻上下吹吸5次,使小球溶解并充分混匀,加盖橙红色盖子并确保盖子盖紧。9.3.2.2DNA模板添加顺序应为:待测样品、阴性对照和阳性对照,以避免交叉污染。9.3.2.3将反应管装进3M分子检测快速转移托盘,关闭并锁定托盘盖。9.3.2.4在3M分子检测软件中查看和确认配置的检测,在软件中单击启动按钮,仪器盖自动打开。9.3.2.5将3M分子检测快速转移托盘放入3M分子检测仪器并关闭盖,启动分析。9.3.2.6为了避免因为交叉污染而导致的假阳性结果,在分析完成后,将快速转移托盘浸入3%84消毒液1h,且始终远离分析准备区。9.4结果观察60min完成扩增,仪器实时自动报告检测结果,具体结果参见附录A的A.2。10结果报告10.1在阴性对照和阳性对照结果均有效的情况下:待测样品检测结果呈阳性,对样品增菌液进一步按照GB4789.40中操作步骤进行确认后报告结果;待测样品检测结果呈阴性,报告未检出克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)。检测结果示意图参见附录C的图C.1。10.2若与上述条件不符,则本次结果无效,应更换试剂按本方法重新检测。4SN/T5368.1—2022附录A(资料性)3MMDS克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检测试剂盒评价结果1)A.1包容性和排他性选择101株经确认的克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)标准菌株和分离菌株,用3MMDS克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)试剂盒方法进行测试,结果全部为阳性。选择30株经确认的非克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的标准菌株,用试剂盒方法进行测试,结果全部为阴性。A.2准确度、特异性、灵敏度及检出限选择5个食品种类,15个食品类型的样品,采用人工污染的方式分别制备未接种(L0)、低(L1)、高(L2)三个污染水平试验样品,分别用3MMDS试剂盒方法和GB4789.40方法进行测试,相对准确度、特异性、灵敏度及检出限结果如表A.1。表A.1灵敏度、特异性、准确度及检出限序号食品基质相对准确度AC相对特异性SP相对灵敏度SE检出限(CFU/g)1饼干100%100%100%0.0912婴儿奶粉99%97%100%0.0913婴儿辅食100%100%100%0.0914冷冻饮品97%100%95%0.0915奶制品100%100%100%0.091A.3耐变性分别对增菌时间(正常设置为18h)、裂解时间(正常设置为15min)和反应体积(正常设置为20μL)三个变量进行耐变性实验,检测结果表明,在裂解时间变化2min、裂解体积变化2μL和反应体积变化2μL的情况下,对克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)分子检测试剂盒方法的检出率没有影响。A.4批间变异取3个不同批号试剂盒分别对含目标菌和非目标菌样品进行批间差异实验,检测结果表明,该试剂盒无显著性批间差异。A.5评价结论试剂盒方法检测结果与参考标准方法检测结果无显著差异,能满足食品样品的检测要求。1)本评价结果仅适用于3MMDS克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)分子检测试剂盒。5SN/T5368.1—2022附录B(规范性)培养基和试剂缓冲蛋白胨水(BPW)的成分和制法如下:a)成分蛋白胨10.0g氯化钠5.0g磷酸氢二钠(含12个结晶水)9.0g磷酸二氢钾1.5g蒸馏水1000mLb)制法将各成分加入蒸馏水中,搅混均匀,静置约10min,煮沸溶解,调节pH至7.2±0.2,于高压灭菌121℃,15min。6SN/T5368.1—2022附录C(资料性)检测结果示意图检测结果示意图:见图C.1。注:红色+为阳性结果,绿色-为阴性结果,阳性对照RC,阴性对照NC。图13MMDS克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)仪器检测结果7SN/T5368.1—20222202—1􀏕8635T/NS中华人民共和国出入境检验检疫行业标准商品化试剂盒检测方法克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)方法一SN/T5368.1—2022*中国海关出版社有限公司出版发行北京市朝阳区东四环南路甲1号(100023)编辑部:[phone]-7530网址中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本880×12301/16印张0.75字数18千字2022年月第一版2022年月第一次印刷印数1—*书号:155175·702定价12.00元