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ICS65.020.20CCSB16中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T5457—2022车前草花叶病毒检疫鉴定方法DetectionandidentificationofPlantagoasiaticamosaicvirus2022-07-07发布2023-02-01实施中华人民共和国海关总署发布学兔兔—2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国大连海关、中华人民共和国厦门海关、吉林省林业科学研究院、沈阳农业大学。本文件主要起草人:李鑫、张寅寅、廖富荣、李立梅、王秀芬、徐君怡、吴元华、于爽。ⅠSN/T5457—2022学兔兔范围本文件描述了车前草花叶病毒检疫鉴定的基本原则和方法。本文件适用于所有进境百合属(Liliumspp.)、车前草(Plantagoasiatica)等寄主植物中车前草花叶病毒的检疫鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T2119进境观赏鳞球茎检疫操作规程SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样方法3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4基本信息中文名:车前草花叶病毒学名:Plantagoasiaticamosaicvirus缩写:PlAMV分类地位:芜菁黄花叶病毒目(Tymovirales)甲型线形病毒科(Alphaflexiviridae)马铃薯X病毒属(Potexvirus)成员。传播途径:种球传播、机械传播。PlAMV的其他信息参见附录A。5原理车前草花叶病毒的血清学、分子生物学特性是检疫鉴定的主要依据。6仪器设备、用具和试剂6.1主要仪器设备、用具微量天平(1/1000g)、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪系统、高速冷冻台式离心机、水浴槽或恒温孵育器、pH计、制冰机、实时荧光PCR、酶标仪、洗板机、冰箱、超低温冰箱、烘箱、高压灭菌锅、1SN/T5457—2022学兔兔标准下载各种量程的可调移液器(1000μL、200μL、100μL、20μL、10μL、2μL)等。6.2主要试剂有特殊说明除外,所有试验用试剂均为分析纯。试验用水应符合GB/T6682的要求。双抗体夹心酶联免疫吸附检测、RT-PCR检测、实时荧光RT-PCR检测试剂应符合附录B、附录C、附录D的规定。7检测与鉴定7.1抽样检查按照SN/T2119、SN/T2122给出的方法进行抽样、取样。若为植株样品,则观察叶片及茎秆是否有褪绿、坏死斑点或斑驳等疑似症状,并采取疑似样品。具体症状参见附录A。若为种球样品,则设定每5个种球为一组样品,进行混合取样。将待检样品带回实验室作进一步检验,记录品种、数量、来源国及取样地点、取样人和取样日期等信息。进行血清学、分子生物学检测。7.2DAS-ELISA检测按附录B执行。7.3RT-PCR检测按附录C执行。7.4实时荧光RT-PCR检测按附录D执行。8结果判定采用7.2方法检测后,若呈阴性反应,则判断为未检出车前草花叶病毒。采用7.2方法检测后,若呈阳性反应,则需采用7.3或7.4中的任一方法进行复核。若复核结果为阳性,则判断为检出车前草花叶病毒;若复核结果为阴性,则判断为未检出车前草花叶病毒。9样品保存与结果记录9.1样品保存经检验确定携带车前草花叶病毒的样品应在合适的条件下保存,百合种球及叶片样品可保存于-80℃冰箱中,或经冻干机冻干后保存。保存期满后,需经灭活处理。9.2结果记录完整的试验记录要包括样品的来源、种类、时间,试验的时间、地点、方法和结果等,并要有经手人和实验人员的签字。双抗体夹心酶联免疫吸附检测应有酶联板反应的原始数据,RT-PCR检测应有电泳结果图片。2SN/T5457—2022学兔兔(资料性)车前草花叶病毒基本信息资料A.1寄主范围该病毒自然寄主包括车前草(Plantagoasiatica)、百合属(Liliumspp.)、樱草属(Primulaspp.)、南天竹(Nandinadomestica)。人工接种的寄主包括藜麦(ChenopodiumquinoaWilld.)、苋色藜(C.amaranticolor)、千日红(Gomphrenaglobosa)、本氏烟(Nicotianabenthamiana)和西方烟(N.occi-dentalis)。A.2地理分布亚洲:印度、日本、韩国、中国台湾。欧洲:匈牙利、意大利、荷兰、俄罗斯、英国。美洲:美国、智利、哥斯达黎加。大洋洲:新西兰。A.3传播途径鳞球茎等繁殖材料是远距离扩散的主要途径;自然条件下机械传播。A.4病毒粒子形态病毒颗粒呈丝线状,长度约490nm~530nm,宽约11nm。A.5症状受感染的百合植株可能没有症状,也可能初期表现出萎黄、斑驳或花叶,常被误认为营养失调导致。而后百合叶下侧的静脉可能呈现锈色、坏死,侵染后期,受感染植株靠上部叶片有明显的斑驳症状,个别叶片边缘出现轻微坏疽,花蕾干枯死亡。发病后期,植株茎秆出现变色坏死状,且随时间延长,坏死部位逐渐扩大。(图A.1)在与其他病毒混合感染的情况下,症状可能更明显,也可能难以与其他病毒或混合感染引起的症状区分开。不同百合品种和品种之间的症状表达差异较大。3SN/T5457—2022学兔兔)叶片斑驳症状b)叶片下边缘坏疽症状c)茎坏死症状d)叶片斑驳症状e)全株症状注:图片引自图A.1车前草花叶病毒在百合植株上的症状4SN/T5457—2022学兔兔(规范性)双抗体夹心酶联免疫吸附(DAS-ELISA)检测方法B.1试剂B.1.1包被缓冲液(pH9.6)碳酸钠(Na2CO3)1.59g碳酸氢钠(NaHCO3)2.93g叠氮钠(NaN3)0.2g蒸馏水定容至1L,4℃储存。B.1.2PBST缓冲液(洗涤缓冲液pH7.4)氯化钠(NaCl)8.0g磷酸氢二钠(Na2HPO4)1.15g磷酸二氢钾(KH2PO4)0.20g氯化钾(KCl)0.20g吐温-20(Tween-20)0.50mL蒸馏水定容至1L,4℃储存。B.1.3样品抽提缓冲液(pH7.4)PBST1L亚硫酸钠(Na2SO3)1.3gPVP(MW24000~40000)20g叠氮钠(NaN3)0.2g4℃储存。B.1.4酶标抗体稀释缓冲液(pH7.4)PBST1L牛血清白蛋白(BSA)或脱脂奶粉2.0gPVP(MW24000~40000)20.0gNaN30.20g4℃储存。B.1.5底物对硝基苯磷酸二钠(ρNPP)B.1.6底物ρNPP缓冲液(pH9.8)氯化镁(MgCl2)0.1g叠氮钠(NaN3)0.2g二乙醇胺97.0mL溶于800mL蒸馏水中,用HCl调pH至9.8,蒸馏水定容至1L,4℃储存。5SN/T5457—2022学兔兔包被抗体用包被缓冲液将抗体按说明稀释,加入酶联板的孔中,100μL/孔,加盖,4℃孵育过夜或37℃孵育2h,清空孔中溶液,PBST洗涤3次,每次3min。B.2.2样品制备待测样品按1∶10(质量:体积,W/V)加入抽提缓冲液,用研钵研磨成浆,2000g/min离心10min,上清即为制备好的检测样品。阴性对照、阳性对照作相应的处理或按照说明书进行。B.2.3加样加入制备好的检测样品、阴性对照、阳性对照,100μL/孔,每一样品设一重复。加盖后于4℃孵育过夜或37℃孵育4h,酶联板用自来水彻底冲洗,再用蒸馏水洗涤1次,PBST洗涤3次,每次3min。B.2.4加酶标抗体用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度,并加入到酶联板中,100μL/孔,加盖,37℃孵育4h,酶联板用自来水彻底冲洗,再用蒸馏水洗涤1次,PBST洗涤3次,每次3min。B.2.5加底物将底物ρNPP加入到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mL(现配现用),按100μL/孔,加入到酶联板中,室温避光孵育。B.2.6读数在不同的时间内如30min、1h、2h或更长时间,用酶联仪在405nm处读OD值。B.3结果判断B.3.1对照孔的OD405值(缓冲液孔、阴性对照孔及阳性对照孔),应该在质量控制范围内:缓冲液孔和阴性对照孔的OD405值0.15,当阴性对照孔的OD405值0.05时,按0.05计算;阳性对照OD405值/阴性对照OD405值5~10,同一样品的重复性基本一致。B.3.2在满足了B.3.1质量要求后,结果原则上可判断如下:样品OD405值/阴性对照OD405值2,判为阳性;样品OD405值/阴性对照OD405值接近阈值,判为可疑样品,需重新做一次,或用其他方法验证;样品OD405值/阴性对照OD405值2,判为阴性。B.3.3若满足不了B.3.1质量要求,则不能进行结果判断。若使用商品化试剂盒,应按照说明书进行操作。6SN/T5457—2022学兔兔(规范性)RT-PCR检测方法C.1主要试剂C.1.1RNA提取试剂TRIzol、三氯甲烷、异丙醇、70%乙醇焦碳二乙酯(DEPC)处理的ddH2O。C.1.2RT-PCR试剂5×RT缓冲液、dNTP混合液(各10mmol/L)、M-MLV反转录酶(200U/μL)、RNA酶抑制剂(RNasin)、10×PCR缓冲液、TaqDNA聚合酶(2.5U/μL)。或采用商品化的试剂盒。C.1.310×TBE缓冲液(Tris-Borate-EDTA)Tris碱108g硼酸55gNa4EDTA9.3g加水溶解,定容到1L。C.1.4电泳试剂琼脂糖、goldview、10×TBE缓冲液。C.1.5引物序列与合成车前草花叶病毒外壳蛋白引物序列见表C.1。表C.1引物序列引物名称序列(5'-3')长度/bp参考文献PlAMV-cpupCCGCGGCCGCCACACTACTC20PlAMV-cpdwGGCCCACCAGACTTTCACT19É.Pájtlietal.,2015C.2总RNA提取采用TRIzol方法提取叶片或带毒种球的总RNA,具体操作如下:取约0.1g样品组织置于研钵中,加入1mLPBST缓冲液研磨,4℃,10000×g离心5min,取上清液并将上清液迅速转移至灭菌的1.5mL离心管中,并加入1mLTRIzol试剂,剧烈振荡后,室温静置5min;4℃,12000×g离心15min,取上层水相;加入等体积的异丙醇,颠倒混匀后室温下静置15min,4℃,12000×g离心10min,弃上清液;加入1mL75%的乙醇洗涤沉淀2次,每次4℃,7500×g离心3min,弃上清液;RNA沉淀干燥后,用20μL~40μL经焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的双蒸水溶解,-20℃保存备用。在能够保证总RNA质量的情况下,也可以采用其他植物总RNA提取方法。7SN/T5457—2022学兔兔合成(反转录)在离心管中加入2μL总RNA、1μL下游引物(PlAMV-cpdw)、双蒸水5μL,70℃水浴10min,迅速冰浴5min,再加入下列试剂:5×RT缓冲液2.5μL、dNTPs(10mmol/L)1μL、M-MLV反转录酶(200U/μL)0.5μL、RNasin