SNT 5450-2022 动物源食品中9种双稠吡咯啶类生物碱的测定 液相色谱-质谱质谱法

ICS67.050CCSX04中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T5450—2022动物源食品中9种双稠吡咯啶类生物碱的测定液相色谱-质谱/质谱法Determinationof9pyrrolizidinealkaloidsinanimal-originfood—Liquidchromatographytandemmassspectrometrymethod2022-03-14发布2022-10-01实施中华人民共和国海关总署发布前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国南京海关、中华人民共和国石家庄海关、中华人民共和国重庆海关、中华人民共和国青岛海关、中华人民共和国杭州海关。本文件主要起草人:丁涛、殷耀、宋卫得、郭思言、张文国、姜珊、季美泉、赵翌龙、马育松、谢文、吴永苹。ⅠSN/T5450—2022动物源食品中9种双稠吡咯啶类生物碱的测定液相色谱-质谱/质谱法1范围本文件规定了动物源食品中9种双稠吡咯啶类生物碱的液相色谱-质谱/质谱测定方法。本文件适用于蜂蜜、乳及乳制品、畜禽肉(牛、猪、鸡)及其内脏中野百合碱、克氏千里光宁碱、倒千里光碱、千里光菲灵碱、千里光宁、立可沙明碱、天芥菜碱、毛果天芥菜碱、蓝蓟定9种双稠吡咯啶类生物碱残留量的测定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4方法提要蜂蜜样品用0.1mol/L盐酸溶液溶解,乳及乳制品用5%三氯乙酸溶液沉淀蛋白,畜禽肉及内脏制品用5%乙酸乙腈溶液提取,混合型强阳离子交换固相萃取柱富集净化,高效液相色谱-质谱/质谱进行测定,外标法定量。5试剂和材料除另有规定外,所有实验用试剂均为分析纯,水为GB/T6682中规定的一级水。5.1乙腈。5.2甲酸。5.3乙酸。5.4甲醇:分析纯和色谱纯。5.5醋酸铵:色谱纯。5.6浓盐酸(36%~38%)。5.7浓氨水(25%~28%)。5.8三氯乙酸。5.9标准品:野百合碱(C16H23NO6,CAS号:315-22-0),克氏千里光宁碱(C19H27NO6,CAS号:2318-18-5),倒千里光碱(C18H25NO6,CAS号:480-54-6),千里光菲灵碱(C18H23NO5,CAS号:480-81-9),千1SN/T5450—2022里光宁(C18H25NO5,CAS号:130-01-8),立可沙明碱(C18H25NO5,CAS号:10285-07-1),天芥菜碱(C16H27NO5,CAS号:303-33-3),毛果天芥菜碱(C21H33NO7,CAS号:303-34-4),蓝蓟定(C20H31NO7,CAS号:520-68-3),纯度≥95%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。5.10盐酸溶液(0.1mol/L):取9mL浓盐酸(5.6)用水定容至1000mL。5.115%三氯乙酸溶液:取50g三氯乙酸(5.8)用水定容至1000mL。5.125%氨水-甲醇溶液:取5mL浓氨水(5.7)用分析纯甲醇定容至100mL。5.131%乙酸乙腈溶液:取10mL乙酸(5.3)用分析纯乙腈定容至1000mL。5.14甲醇水溶液:取10mL色谱纯甲醇(5.4),用水定容至100mL。5.15混合型强阳离子固相萃取柱(60mg或相当者):使用前依次用3mL甲醇、3mL水、3mL0.1mol/L盐酸活化,保持柱体湿润。5.16标准储备液:分别称取9种双稠吡咯啶类生物碱标准品(5.9)各10mg于10mL容量瓶中,用色谱纯甲醇(5.4)溶解,配制成1mg/mL的标准储备液。再分别准确吸取1mg/mL的9种单标准储备液,用色谱纯甲醇(5.4)逐级稀释到10μg/mL和1μg/mL的混合标准溶液,于4℃冰箱保存。5.17标准工作溶液:吸取适量1μg/mL标准储备液(5.16),用色谱纯甲醇(5.4)释成浓度范围为20ng/mL~300ng/mL系列标准工作溶液,现配现用。5.18滤膜:有机相、水相0.22μm。5.19定性滤纸。6主要仪器和设备6.1液相色谱-串联质谱仪:配备电喷雾离子源(ESI)。6.2天平:感量为0.1mg和0.01g。6.3氮吹仪。6.4涡旋振荡混合器。6.5离心机:转速≥12000r/min。6.6固相萃取仪。6.7具塞离心管:50mL。6.8组织绞碎机。7样品制备与保存取混合均匀蜂蜜、乳及乳制品、畜禽肉及其肝脏代表样品后装入洁净容器内,密封,标明标记,蜂蜜和乳粉于室温避光保存,其他样品于-18℃下保存。8测定步骤8.1供试样品提取和净化称取2g蜂蜜样品(精确至0.01g)于50mL带盖聚四氟乙烯离心管中,加入10mL0.1mol/L盐酸(5.10),涡旋混合均匀后准备净化。称取5g液态乳或2g乳粉样品(精确至0.01g)于50mL带盖聚四氟乙烯离心管中,加入10mL5%三氯乙酸溶液(5.11),涡旋1min,超声20min,高速离心后定性滤纸过滤,滤液准备净化。混合型强阳离子固相萃取柱(5.15)预先用3mL分析纯甲醇和3mL0.1mol/L盐酸活化,将样品溶液以小于1mL/min流速过柱,依次用3mL水和3mL分析纯甲醇淋洗,加入5mL5%氨水-甲醇溶2SN/T5450—2022液(5.12)洗脱,收集的洗脱液于40℃下氮气吹干,用1.0mL甲醇水(5.14)溶液溶解,依次过有机和水相滤膜(5.18)后供高效液相色谱串联质谱测定分析测定。准确称取5g动物内脏及肉样品于50mL带盖聚四氟乙烯离心管中,加入20mL乙酸乙腈溶液(5.13),涡旋后超声20min,高速离心后过定性滤纸,残渣再加入15mL乙酸乙腈溶液(5.13)重复提取1次,合并过滤溶液,于40℃水浴温度下旋转蒸发至干,用1.0mL甲醇水(5.14)定容,依次过有机和水相滤膜(5.18)后供高效液相色谱串联质谱测定分析测定。8.2测定8.2.1仪器条件8.2.1.1液相色谱参考条件液相色谱参考条件如下:a)色谱柱:EpicC18MS4.6mm(内径)×150mm,3μm或相当者;b)流动相流速:0.5mL/min;c)柱温:40℃;d)进样量:20μL;e)梯度洗脱,流动相A为甲醇,流动相B为0.1%(v/v)甲酸-5mmol/L醋酸铵溶液,参考洗脱程序见表1。表1高效液相色谱参考梯度洗脱程序时间/min流速/(mL/min)流动相A/%流动相B/%00.5109030.510904.50.59010100.59010110.51090130.510908.2.1.2质谱参考条件质谱参考条件如下:a)电离方式:电喷雾(ESI+);b)扫描方式:正离子扫描;c)检测模式:多反应监测(MRM);d)雾化气、气帘气、辅助气、碰撞气均为高纯氮气;使用前应调节各参数使质谱灵敏度达到检测要求,参考条件及监测离子对(m/z)参见表A.1。8.2.2液相色谱-串联质谱测定8.2.2.1定性测定按照液相色谱-串联质谱条件测定试样和基质混合标准工作液,试样中目标化合物的保留时间与基质混合标准工作液中对应化合物的保留时间偏差在±2.5%之内;定性离子对的相对丰度与浓度相当的基质混合标准工作液的相对丰度一致,相对丰度偏差不超过表2的规定,且每个离子的信噪比均≥3,则3SN/T5450—2022可判断试样中存在相应的被测物。表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度/%5020~5010~20≤10允许的相对偏差/%±20±25±30±508.2.2.2定量测定本文件双稠吡咯啶类生物碱采用外标法定量测定,根据样液中被测物的含量情况,选定浓度相近的标准工作溶液。标准溶液和样液中双稠吡咯啶类生物碱的响应值均应在仪器检测线性范围内。对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定。在上述仪器条件下,双稠吡咯啶类生物碱的参考保留时间见附录B。8.3空白试验除不称取试样外,均按上述测定条件和步骤进行。9结果计算与表述用LC-MS/MS数据处理系统或按式(1)计算试样中双稠吡咯啶类生物碱的残留量:Xi=Ci-C0m×V×10001000…………………………(1)式中:Xi———试样中双稠吡咯啶类生物碱的残留量,单位为微克每千克(μg/kg);Ci———标准工作溶液中生物碱的浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL);C0———由标准曲线而得到的空白试验样液中生物碱的含量,单位为纳克每毫升(ng/mL)V———样品定容体积,单位为毫升(mL);m———最终样液所代表的试样质量,单位为克(g)。注:计算结果需将空白值扣除结果,结果保留2位有效数字。10定量限与回收率10.1检出限和定量限野百合碱、克氏千里光宁、倒千里光碱、千里光菲灵碱、千里光宁、天芥菜碱、立可沙明碱、毛果天芥菜碱和蓝蓟定检出限均为3μg/kg,定量限均为10μg/kg。10.2回收率样品的添加浓度及回收率数据见表C.1。4SN/T5450—2022附录A(资料性)参考质谱条件质谱参考条件如下:a)电喷雾模式:ESI+;b)喷雾电压:5500V;c)去簇电压:80V;d)帘气:379kPa(55psi);e)碰撞气:34.5kPa;f)离子源温度:550℃;g)雾化气:379kPa(55psi);h)辅助气:241kPa(35psi)。表A.1定量离子对、监测离子对、去簇电压、碰撞气能量序号化合物定量离子对/(m/z)监测离子对/(m/z)去簇电压(DP)/V碰撞气能量(CE)/eV1倒千里光碱352.3/120.2352.3/120.270.439.2352.3/138.372.538.72野百合碱326.6/121.4326.6/121.497.442.1326.6/237.2100.631.43千里光菲灵碱334.4/307.4334.4/307.4114.336.8334.4/120.5118.940.24千里光宁336.3/120.2336.3/120.296.741.3336.3/138.296.938.25克氏千里光碱366.5/168.3366.5/168.3126.240.5366.5/151.3128.4376立可沙明碱300.6/94.1300.6/94.1125.130.1300.6/156.2113.237.97天芥菜碱314.5/138.0314.5/138.0128.130.7314.5/156.2102.234.88毛果天芥菜碱412.7/120.1412.7/120.196.130.9412.7/220.296.823.89蓝蓟定398.4/120.1398.4/120.1117.226.4398.4/220.1116.221.75SN/T5450—2022附录B(资料性)9种双稠吡咯啶类生物碱液相色谱-串联质谱的多反应监测(MRM)图图B.19种双稠吡咯啶类生物碱(50ng/mL)液相色谱-串联质谱的MRM图6SN/T5450—2022图B.19种双稠吡咯啶类生物碱(50ng/mL)液相色谱-串联质谱的MRM图(续)7SN/T5450—2022图B.19种双稠吡咯啶类生物碱(50ng/mL)液相色谱-串联质谱的MRM图(续)8SN/T5450—2022附录C(资料性)添加水平、回收率及精密度表C.19种双稠吡咯啶类生物碱的添加回收率及精密度化合物10μg/kg、20μg/kg和50μg/kg添加水平下回收率(%)/相对标准偏差(%)洋槐蜜麦卢卡蜂蜜液态乳乳粉鸡肝鸡肉猪肉猪肝牛肉牛肝野百合碱84.0~98.0/4.0~6.676.0~91.0/4.4~6.581.8~98.0/4.5~7.975.0~91.0/5.2~8.27