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ICS65.020.20CCSB16中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T5545—2022猕猴桃果腐病菌检疫鉴定方法DetectionandIdentificationofNeofabraeaactinidiae2022-07-07发布2023-02-01实施中华人民共和国海关总署发布学兔兔—2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:天津海关动植物与食品检测中心、中华人民共和国上海海关、重庆海关技术中心、成都海关技术中心。本文件主要起草人:张莹、罗加凤、刘鹏、胡佳续、廖芳、焦彬彬、滕少娜、邵宝林、张裕君、贺艳。ⅠSN/T5545—2022学兔兔范围本文件规定了猕猴桃果腐病菌的检疫鉴定方法。本文件适用于猕猴桃果腐病菌相关寄主中猕猴桃果腐病菌的检疫鉴定。2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4基本信息中文名:猕猴桃果腐病菌学名:Neofabraeaactinidiae无性态:Cryptosporiopsisactinidiae英文名:Fruitrotsofkiwifruit分类地位:猕猴桃果腐病菌属真菌界(Fungi)、子囊菌门(Ascomycota)、盘菌亚门(Pezizomycoti-na)、锤舌菌纲(Leotiomycetes)、柔膜菌目(Helotiales)、皮盘菌科(Dermataceae)、明孢盘菌属(Neofab-raea)。传播途径:由带菌果实及枝条进行远距离传播。猕猴桃果腐病菌的其他信息参见附录A和附录B。5方法原理以病原菌的危害症状、分离培养性状、形态学特征、ITS序列特征作为猕猴桃果腐病菌的检疫鉴定依据。6检测流程猕猴桃果腐病菌检测流程见图1。1SN/T5545—2022学兔兔器材灭菌培养皿、三角瓶、镊子、手术剪、手术刀、接种刀、脱脂棉、酒精灯。体式显微镜、生物显微镜、超净工作台、培养箱、电子天平、高压灭菌锅、常规冰箱、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像仪、高速冷冻离心机、恒温水浴锅。7.2试剂乙二胺四乙酸(EDTA)、十二烷基磺酸钠(SDS)、Tris-HCl、异戊醇、三氯甲烷、无水乙醇、70%乙醇、1%次氯酸钠、氯化钾、氯化镁、蛋白酶K、引物ITS4/ITS5、Taq聚合酶等分子生物学试剂,植物组织及真菌基因组提取试剂盒。马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA):马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蒸馏水定容至1000mL,121℃高压灭菌20min。8鉴定方法8.1症状检查病菌在枝条上潜伏侵染,不表现症状。在果实表面、蒂部为圆形褐色病斑(附录A),将枝条和可疑果实样品进行分离培养。8.2分离培养将枝条剪成小段,用1%的次氯酸钠表面消毒5min,无菌水冲洗3遍,置于PDA培养基上于20℃培养。用70%乙醇对病果表面消毒,挑取病斑处霉层或病健交界处果肉组织,置于PDA培养基上于20℃培养。长出菌丝后,从菌落边缘挑取菌丝移至新的PDA培养基上纯化。2SN/T5545—2022学兔兔形态学观察观察记录菌落培养性状,包括菌落颜色、形状等,在显微镜下观察分生孢子形状,测量记录30个分生孢子大小。8.4ITS扩增及序列分析8.4.1菌丝DNA提取采用CTAB提取法或基因组提取试剂盒制备DNA,见附录C。8.4.2PCR检测PCR检测方法见附录D。8.5致病性测定必要时(如首次截获等),进行致病性测定。可选用猕猴桃果腐病菌感病品种绿心猕猴桃(Actinidiadeliciosacv.“Hayward”)和黄金猕猴桃(A.chinensis“Hort16A”)的健康果实接种,用70%乙醇对果实表面进行擦拭消毒。采用灭菌针刺出伤口,挑取适量菌丝,将其接种在伤口上,用湿润的灭菌脱脂棉覆盖伤口,设置无菌水空白对照。将接种后的果实放入无菌塑料袋中,于20℃~22℃保湿2d,室温下继续培养观察,3d后出现症状,取发病部位的病健交界组织进行病原菌再分离。9鉴定特征9.1培养性状菌落圆形,边缘整齐,气生菌丝絮状,在菌落中部增厚稍隆起,菌丝浅粉色或白色,培养5d左右,菌株在PDA培养基上产生鲜艳的色素,橙红色或鲜红色(附录B)。9.2形态特征猕猴桃果腐病菌的载孢体为枕状分生孢子盘,培养5d~7d后产生。产孢细胞由菌丝直接产生,或着生于分生孢子梗顶端,分生孢子梗紧密排列在分生孢子盘中或产生于菌丝不规则分枝上。产孢细胞单胞、无色,圆柱形,顶端渐细,具有较明显的喇叭形产孢痕迹。产孢细胞大小(8.5μm~14.5μm)×(3μm~4μm)。产孢细胞内壁芽生出大量分生孢子。分生孢子单胞、无色,长椭圆形、椭圆形或卵形,直或微弯,有或无油球,末端宽圆,基部有明显的着生痕迹。分生孢子大小(5μm~14μm)×(3μm~5.5μm),平均10.2μm×4.0μm(附录B)。9.3ITS序列比对经BLAST分析,PCR扩增到的ITS基因序列与NCBI网站GenBank中登录号为NR_155469的Neofabraeaactinidiae序列同源性为99%~100%,则判定为阳性。9.4致病性测定的症状表现接种3d~5d后,猕猴桃开始发病,接种部位出现褐色圆形病斑,病斑凹陷,棕色或暗红色,2d后病斑处有白色稀疏霉层。取发病果实的病健交界处进行分离培养,获得的分离菌与原接种菌形态特征相同。3SN/T5545—2022学兔兔中描述,ITS序列比对结果与9.3描述相符,判定检出猕猴桃果腐病菌,否则判定未检出猕猴桃果腐病菌。11菌株保存与处理分离并最终鉴定为猕猴桃果腐病菌的菌株应转入PDA培养基斜面上,存活后经登记和经手人签字,置于4℃黑暗条件下保存,定期(3个月)转接,以防止病菌死亡,至少保存6个月,以备复验、谈判和仲裁。必要时用病菌分生孢子作冻干菌种保存。保存期满后高压灭活处理。4SN/T5545—2022学兔兔(资料性)猕猴桃果腐病菌其他信息A.1寄主范围病菌主要危害猕猴桃属(Actinidiaspp.)植物,如软枣猕猴桃(A.arguta)、美味猕猴桃(A.deli-ciosa)、中越猕猴桃(A.indochinensis)、中华猕猴桃(A.chinensis)等,引起果实腐烂;此外,苹果(Malusdomestica)、柿子树(Diospyrosvirginiana)、红桉树(Eucalyptusdiversicolor)以及天然林上也有该菌的分离记录。A.2分布新西兰,澳大利亚,荷兰。A.3症状猕猴桃果腐病菌主要危害猕猴桃果实。在猕猴桃果实蒂部出现褐色病变,果实表面有圆形褐色病斑,病斑表面可见白色稀疏菌丝,剖开病斑处果皮,可见浅黄色真菌侵蚀点,侵蚀点为圆形,质地较硬、较干燥。该病菌接种苹果果实可产生牛眼状病斑,在柿子树、红桉树及天然林枝条上潜伏侵染,不表现症状。a)黄金猕猴桃SunGold-3279蒂部褐色病变b)绿心猕猴桃Green-4030表面褐色圆形病斑c)猕猴桃病果内部浅黄色真菌侵蚀点图A.1猕猴桃果腐病菌在猕猴桃果实上的症状(张莹拍摄)5SN/T5545—2022学兔兔(资料性)猕猴桃果腐病菌菌落及形态特征图a)带有白色絮状菌丝的圆形橙红色菌落b)分生孢子盘c)分生孢子梗和产孢细胞d)单孢、无色的分生孢子图B.1PDA上菌落培养性状及病菌形态特征(张莹、罗加凤拍摄)6SN/T5545—2022学兔兔(规范性)菌丝DNA提取方法收集分离培养得到的菌丝,用灭菌滤纸吸干水分,放入1.5mL离心管中,加液氮冷冻,用塑料杵磨碎,待用。离心管加入400μL~500μL2×CTAB缓冲液和0.1g蛋白酶K,混匀,65℃水浴1h,14000g离心5min,保留上清液;加500μL的Tris饱和酚:三氯甲烷:异戊醇(25∶24∶1)混匀,14000g离心5min;取上清液于1.5mL离心管中,加入500μL三氯甲烷:异戊醇(24∶1)轻摇混匀,14000g离心5min;取上清液,加入1mL异丙醇混匀,-70℃下放置1h,或-20℃过夜;13000g离心10min,可见DNA沉淀;弃去上清液,70%乙醇洗DNA沉淀2次,室温干燥;用30μL~50μLTris-EDTA缓冲液溶解DNA。7SN/T5545—2022学兔兔(规范性)PCR方法D.1引物序列采用ITS4/ITS5引物进行扩增,目标片段为570bp。ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ITS5:5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’注:引自JohnstonPRetal,2004。D.2PCR反应体系30μL反应体系中含:10×PCRbuffer(含Mg2+)3μL,dNTPs(2.5mmol/L)2μL,上下游引物(10μmol/L)各1.0μL,TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.4μL,DNA模板1.0μL(30ng/μL),ddH2O21.6μL。阳性对照以猕猴桃果腐病菌DNA为模板,阴性对照以猕猴桃果腐病菌的近似种苹果牛眼果腐病菌等DNA为模板,以灭菌去离子水作空白对照。D.3扩增条件PCR反应程序:94℃预变性3min;94℃变性30s,55℃复性30s,72℃延伸1min,35个循环;72℃7min,保存于4℃。D.4序列分析扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳,EB或GelRed等核酸染料染色后凝胶成像(也可将GelRed等核酸染料直接加入凝胶中),如有目标片段大小的单带出现,扩增产物进行序列测定。将测序获得的序列与NCBI网站GenBank中相关序列进行同源性比对分析。8SN/T5545—2022学兔兔标准下载参考文献[1]JohnstonPR,ManningMA,MeierX,etal.Cryptosporiopsisactinidiaesp.nov.Myco-taxon,2004,89(1):131-136.[2]JohnstonPR,SeifertKA,StoneJK,etal.Recommendationsongenericnamescompe-tingforuseinLeotiomycetes(Ascomycota).IMAFUNGUS,2014,5(1):91-120.[3]DavisonEM,CunningtonJH,TayFCS.FirstrecordofCryptosporiopsisactinidiaeinAustralia.AustralianPlantDiseaseNotes,2009,4.66-67.[4]FullertonRA,RheinländerPA,ManningMA,etal.InfectionandRotExpressionbyCryptosporiopsisactinidiaeandPhomopsissp.inKiwifruit,Actinidiachinensis“Hort16A”.ActaHortic,2007,753,653-661.[5]ChenC,VerkleyGJM,SunG,etal.RedefiningcommonendophytesandplantpathogensinNeofabraea,Pezicula,andrelatedgenera,FungalBiology,2016,120:1291-1322.[6]WurmsKV,AhCheeA,Reglin