SNT 5380-2022 筑紫蜗牛检疫鉴定方法

ICS65.020.01CCSB16中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T5380—2022筑紫蜗牛检疫鉴定方法DetectionandidentificationofEuhadraherklotsi(Martens,1861)2022-07-07发布2023-02-01实施中华人民共和国海关总署发布学兔兔—2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国福州海关。本文件主要起草人:林阳武、王沛、胡美玲、周卫川。ⅠSN/T5380—2022学兔兔(Martens,1861)的检疫鉴定方法。本文件适用于筑紫蜗牛的检疫鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T3067—2011软体动物常规检疫规范3术语与定义SN/T3067—2011界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1壳口aperture贝壳开口部位,是蜗牛头和腹足的出口。注:壳口形状多变,有圆形、椭圆形、卵圆形、马蹄形等。3.2胼胝部callose内唇贴覆于体螺层上形成胼胝部。3.3矢囊dartsack矢囊是蜗牛生殖系统中一个藏有1枚中空的钙质或壳质骨针的肌肉质的囊。注:一般用长径与短径之比来描述矢囊的相对长度。3.4鞭状体flagellum鞭状体是蜗牛雄性生殖系统中的附器,一般由阴茎本体末端分枝形成鞭状体。3.5口唇lip贝壳壳口的边缘为口唇。注:口唇按其在壳口中的位置不同可分为内唇、外唇、轴唇、上唇和下唇,靠近螺轴的口唇即称轴唇,有些种类的轴唇常外折导致脐孔部分或完全被覆盖。3.6缝合线suture蜗牛贝壳各螺层之间下陷的连接处。注:缝合线有深有浅,有简单的或锯齿形的。1SN/T5380—2022学兔兔基本信息学名:Euhadraherklotsi(Martens,1861)。中文名:筑紫蜗牛。分类地位:软体动物门Mollusca,腹足纲Gastropoda,肺螺亚纲Pulmonata,柄眼目Stylomma-topgora,巴蜗牛科Bradybaenidae,真厚螺属EuhadraPilsbry,1890。该属共有22个种,其中左旋种有5个,右旋种有17个。筑紫蜗牛的近似种主要有阿玛丽真厚螺E.amaliae(Kobelt,1875)和亚颏真厚螺E.subnimbosa(Kobelt,1894)。筑紫蜗牛的其他信息见附录A。5原理筑紫蜗牛的传播特点是不需要特定的寄主,凡接触过的物品都可传播。传播方式和生态习性是确定现场检疫方式的依据。贝壳形态、生殖系统形态和分子特征是实验室鉴定的主要依据。6器具和试剂6.1仪器和用具仪器:体视显微镜、微型离心机、恒温金属浴、PCR仪、凝胶成像系统。用具:放大镜、手电筒、塑料自封袋、广口标本瓶、4mm孔径土壤筛、小铁铲、游标卡尺、搪瓷盘、培养皿、镊子、剪刀、小剪刀、显微镊子、显微剪刀、微针(直径0.15mm)、解剖蜡盘、标签、1.5mL离心管、0.2mLPCR反应管、移液枪。6.2试剂除另有规定外,所有试剂均为分析纯。75%乙醇、无水乙醇、硫酸镁、动物基因组DNA提取试剂盒、PCRMasterMix、ddH2O。7现场检疫对来自疫区(见附录A)的运输工具和货物实施重点查验。仔细检查运输工具、木质包装材料、未经加工的植物性材料等是否有蜗牛附着。筑紫蜗牛昼伏夜出,尤其要注意阴暗潮湿避光处的检查,用手电筒仔细寻找蜗牛的行迹。蜗牛爬行过后,一般都会留下银灰色的丝带状黏液痕迹,这是判定是否有蜗牛污染的重要依据。若发现蜗牛,及时将其装入塑料自封袋或标本瓶带回实验室做进一步的检验鉴定。发现盆景等携带土壤或其他细碎衬垫材料时,需过筛检查是否有卵或幼螺。8实验室鉴定8.1饲养单独查获的卵粒,按照SN/T3067—2011中8.4方法,将其孵化和饲养为成螺后,再做鉴定。8.2测量、观察和软体解剖用游标卡尺测量蜗牛贝壳的壳高和壳宽、卵粒直径。用肉眼或放大镜或体视显微镜仔细观察卵和2SN/T5380—2022学兔兔标准下载螺的形态特征。将闷杀处理后的标本,按照SN/T3067—2011中8.3.1进行软体解剖,分离出生殖系统。8.3真厚螺属EuhadraPilsbry,1890鉴定特征壳高11.3mm~38.0mm,壳宽20.5mm~57.0mm,个体较大。呈矮圆锥形,壳质或薄或厚,有5个~7个适度膨胀的螺层。最后一个螺层圆形,在前方极度下陷。壳面微黄色、桃红色至黑色,大多数情况下具有3条黑色的色带或完全缺乏,有时有大理石样花纹或者浅的辐射状标记。胚螺层光滑,次体螺层有辐射状刻纹和螺旋状的凹痕。壳口椭圆形或马蹄形,倾斜,口唇宽大且外折,颜色多变,从浅黄色至深紫色。脐孔大而深,周围紫褐色或与壳面颜色一致。该属大多数种贝壳右旋,少数种贝壳左旋。8.4筑紫蜗牛Euhadraherklotsi(Martens,1861)鉴定特征8.4.1卵圆形,乳白色至黄色,直径2mm左右。8.4.2贝壳8.4.2.1成螺壳高11.5mm~25.0mm,壳宽20.5mm~36.1mm,贝壳大,壳质厚,坚实,呈矮圆锥形。有5个~6个螺层,前几个螺层缓慢增长,略膨胀,螺旋部低矮。体螺层近圆形,膨大,其高度约为壳高的2/3,在壳口处向右下方倾斜。壳顶钝,缝合线深。壳面颜色多变,乳白色、浅黄色、紫褐色,有稠密而较粗的生长线和刻纹。体螺层周缘有一条螺旋状的紫褐色条带,并向螺旋部延伸,逐渐靠近缝合线,最终与缝合线完全重叠。壳口马蹄形,向下倾斜。口唇外折,厚,浅紫色。轴唇在脐孔处略外折,内唇贴覆于体螺层上,形成稍厚的胼胝部。脐孔大而深,呈洞穴状,周围紫褐色(见图B.1)。8.4.2.2幼螺幼螺贝壳外形与成螺基本相似,但个体较小,口缘不外折。8.4.3螺体浅褐色,软体背部颜色较深。8.4.4生殖系统矢囊大,副矢囊中等大小,为长柱形。黏液腺约13枝,呈放射状排列。受精囊椭圆形,受精囊柄长。输卵管中等粗细。输精管细,长度约为输卵管的2.5倍。鞭状体末端细小。阴茎牵引肌略粗,短。阴茎长,中等粗细(见图B.2)。8.4.5COI基因序列鉴定按照附录C规定的方法提取DNA,PCR扩增和双向测序,将所测序列与Genbank登录号为MK281333已知筑紫蜗牛的线粒体COI基因序列进行比对,相似度不小于95%确定为筑紫蜗牛疑似样品。8.5筑紫蜗牛与近似种的区别筑紫蜗牛与其近似种的贝壳在螺旋部、生长线、螺纹、脐孔、次体螺层螺旋状凹痕、周缘棱角方面有差异,详细鉴别特征见附表D。3SN/T5380—2022学兔兔结果判定以贝壳形态和生殖系统形态为基本鉴定依据,螺体的特征作为参考,分子检测为辅助鉴定方法,并注意与近似种的鉴别(见附录D)。符合8.4.2或同时符合8.4.3、8.4.4形态特征的蜗牛判定为筑紫蜗牛。单独查获的卵粒符合8.4.1形态特征,需通过孵化和饲养实验,做进一步的鉴定。符合8.4.5确定为筑紫蜗牛的疑似样品,需进一步进行形态鉴定。10标本处理和保存10.1标本处理标本处理按照SN/T306—2011的规定执行。10.2标本保存经过鉴定后的筑紫蜗牛标本应永久保存,并注明时间、产地、寄主、采集人等信息。4SN/T5380—2022学兔兔(资料性)筑紫蜗牛的寄主、地理分布及其他信息A.1寄主杂食性,幼螺以植物的幼苗和嫩芽为食,成螺取食各种绿色植物的茎和叶。A.2地理分布日本。A.3生物学与危害性筑紫蜗牛昼伏夜出,常藏匿于潮湿阴暗处,可以休眠方式随货物和木质包装材料远距离传播。常生活在山区、丘陵地带潮湿的灌木丛、草丛中,石块或落叶下,多石灰岩的地方,喜食植物的嫩叶及嫩芽部分。其不但可直接危害各种蔬菜、瓜果、花卉和农作物,为农业生产上的重要有害生物,而且也是许多人畜共患寄生虫的中间宿主,影响人畜健康。此外,该螺爬行过后可留下银灰色的黏液痕迹,严重降低水果蔬菜等作物的商品价值。5SN/T5380—2022学兔兔(资料性)筑紫蜗牛的形态特征筑紫蜗牛的形态特征见图B.1及图B.2。注:上为正侧面,左下为腹面,右下为背面。图B.1成螺贝壳的形态特征6SN/T5380—2022学兔兔—2022学兔兔(规范性)筑紫蜗牛COI基因鉴定方法C.1DNA提取取腹足肌肉约10mg~30mg,用DNA提取试剂盒按照商品化试剂盒说明书提取基因组DNA。C.2COI基因引物LCO1490:5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’HCO2198:5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’C.3反应体系反应体系为20μL:其中DNA模板2μL(100ng/μL),LCO1490(10μmol/L)0.5μL,HCO2198(10μmol/L)0.5μL,2×MasterMix10μL,ddH2O7μL。C.4PCR扩增条件94℃5min;94℃50s、45℃30s、72℃50s,30个循环;72℃10min、4℃终止。C.5测序将PCR扩增样品送有资质的生物技术公司测序。C.6比对鉴定双向测序获得长度约为533bp的DNA序列,经软件拼接和人工校对后,与Genbank登录号为MK281333已知筑紫蜗牛的标准COI基因序列进行比对,一致性不小于95%的待鉴样品确定为筑紫蜗牛的疑似样品,需参考其形态特征进行结果判定。8SN/T5380—2022学兔兔(资料性)筑紫蜗牛与近似种的鉴别筑紫蜗牛与近似种的鉴别见表D.1。表D.1筑紫蜗牛与近似种的鉴别特征比较特征种名筑紫蜗牛E.herklotsi(Martens,1861)阿玛丽真厚螺E.amaliae(Kobelt,1875)亚颏真厚螺E.subnimbosa(Kobelt,1894)螺旋部稍高高稍低生长线稠密、粗弱弱螺纹粗细小、不清晰细小、不清晰次体螺层螺旋状凹痕有有无脐孔深、开放,轴缘不覆盖深、开放,轴缘覆盖多于1/3略大,轴缘不覆盖周缘棱角不明显明显不明显贝壳形态9SN/T5380—2022学兔兔—0835T/NS中华人民共和国出入境检验检疫行业标准筑紫蜗牛检疫鉴定方法SN/T5380—2022*中国海关出版社有限公司出版发行北京市朝阳区东四环南路甲1号(100023)编辑部:[phone]-7530网址中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本880×12301/16印张1字数24千字2023年1月第一版2023年1月第一次印刷印数1—500*书号:155175·704定价16.00元学兔兔标准下载