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ICS65.020.01CCSB16中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T5469—2022铁皮石斛鉴定方法DetectionandidentificationofDendrobiumcatenatumLindl.2022-07-07发布2023-02-01实施中华人民共和国海关总署发布学兔兔—2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国拱北海关技术中心、中华人民共和国上海海关动植物与食品检验检疫技术中心、中华人民共和国杭州海关技术中心、中华人民共和国海口海关热带植物隔离检疫中心。本文件主要起草人:张卫东、李伟刚、水克娟、薛华杰、张明哲、潘英文、黄永辉、权永兵、徐淼锋、廖力、林伟、闫邦奇。ⅠSN/T5469—2022学兔兔条形码检验鉴定方法。本文件适用于铁皮石斛及其产品的鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1萼片sepal花的外轮花被片。注:包括1片中萼片(背萼片)和2片侧萼片。3.2花瓣petal内轮花被片中的左右两片。3.3蕊柱column融合有雄性及雌性生殖器官的柱状结构。3.4唇瓣labellum内轮花被片中央的1片变态而成,常有鲜艳的色泽和复杂的结构。4铁皮石斛基本信息学名:DendrobiumcatenatumLindl.中文名:铁皮石斛异名:DendrobiumofficinaleKimura&Migo;DendrobiumtosaenseMakino;Dendrobiumfunius-hanenseT.B.Chao,Z.X.Chen&Z.K.Chen;DendrobiumperefaurieiHayata;Dendrobiumstrick-landianumRchb.f.;Callistastricklandiana(Rchb.f.)Kuntze俗名:黑节草、黄石斛分类地位:被子植物Angiosperms,单子叶植物分支Monocots,天门冬目Asparagales,兰科Orchi-1SN/T5469—2022学兔兔石斛属Dendrobium。5方法原理根据石斛属的内转录间隔区(internaltranscribedspacer2,ITS2)序列特征,应用DNA条形码技术对铁皮石斛进行鉴定,通过肉眼、放大镜和体视显微镜观察铁皮石斛的茎、叶和花等形态特征进行种类鉴定。6主要仪器设备、用具和试剂6.1主要仪器设备PCR仪、电泳仪、凝胶成像分析系统、体视显微镜、生物显微镜、分析天平(感量0.1mg)、低温冷冻高速离心机、微量分光光度仪、组织研磨器、生物安全柜、冰箱。6.2用具移液器(1000μL、200μL、100μL、10μL、2.5μL)及配套枪头、放大镜、离心管、研钵、镊子等。6.3主要试剂Tris饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、75%乙醇、95%乙醇、十二烷基硫酸钠(SDS)、PVP40、β-巯基乙醇、蛋白酶K(20mmol/μL)、RNaseA、液氮、TE缓冲液、10×PCR缓冲液、氯化镁(25mmol/L)、dNTP(10mmol/L)、Taq酶(5U/μL)、引物、琼脂糖、DNA分子量标记和电泳缓冲液。除另有规定外,所有试剂均为分析纯,试验用水应符合GB/T6682中相关规定。7鉴定方法7.1形态学鉴定通过肉眼、放大镜和体视显微镜观察铁皮石斛的茎、叶和花,依据其与近似种的形态特征(参见附录A、附录B)进行种类鉴定。7.2分子生物学检测7.2.1DNA提取铁皮石斛DNA提取方法按附录C执行。7.2.2PCR检测铁皮石斛PCR检测应设置空白核酸提取对照和空白扩增对照,每个样品设置两个平行反应,具体方式按照GB/T19495.2中相关规定进行。具体操作按附录D执行,铁皮石斛及常见近似种ITS2基因序列表信息参见附录E。8形态学鉴定特征8.1石斛属主要形态特征附生草本。茎丛生,少有疏生在匍匐茎上的,直立或下垂,圆柱形或扁三棱形,不分枝或少数分枝,2SN/T5469—2022学兔兔标准下载具少数或多数节,有时1至数个节间膨大成种种形状,肉质(亦称假鳞茎)或质地较硬,具少数至多数叶。叶互生,扁平,圆柱状或两侧压扁,先端不裂或2浅裂,基部有关节和通常具抱茎的鞘。总状花序或有时伞形花序,直立,斜出或下垂,生于茎的中部以上节上,具少数至多数花,少有退化为单朵花的;花小至大,通常开展;萼片近相似,离生;侧萼片宽阔的基部着生在蕊柱足上,与唇瓣基部共同形成萼囊;花瓣比萼片狭或宽;唇瓣着生于蕊柱足末端,3裂或不裂,基部收狭为短爪或无爪,有时具距;蕊柱粗短,顶端两侧各具1枚蕊柱齿,基部具蕊柱足;蕊喙很小;花粉团蜡质,卵形或长圆形,4个,离生,每2个为一对,几无附属物。8.2铁皮石斛形态特征8.2.1基本生物学特性多年生草本。8.2.2植株形态特征8.2.2.1茎铁皮石斛的茎直立,圆柱形,长约9cm~35cm,粗2mm~4mm,不分枝,具多节,节间长1.3cm~1.7cm。8.2.2.2叶叶二列,互生于茎的中部以上,通常3枚~5枚,纸质,长圆状披针形,长3cm~4cm,宽9mm~11mm,先端钝并且多少有钩转,基部下延为抱茎的鞘,边缘和中脉常带淡紫色。叶鞘常具紫斑,老时其上缘与茎松离而张开,并且与节留下1个环状铁青的间隙。8.2.2.3花总状花序从落了叶的老茎上部发出,通常2朵~3朵花。花序柄长5mm~10mm,基部具2枚~3枚短鞘,花序轴回折状弯曲,长2cm~4cm。花苞片干膜质,浅白色,卵形,长5mm~7mm,先端稍钝。花梗和子房长2cm~2.5cm。萼片和花瓣为黄绿色,长圆状披针形,长约1.8cm,宽4mm~5mm,先端锐尖,具5条脉,侧萼片基部较宽阔,宽约1cm。唇瓣白色,基部具1个绿色或黄色的胼胝体,卵状披针形,比萼片稍短,中部反折,先端急尖,不裂或不明显3裂,中部以下两侧具紫红色条纹,边缘多少呈波状。唇盘密布细乳突状的毛,并且在中部以上具1个紫红色斑块。萼囊圆锥形,长约5mm,末端圆形。蕊柱黄绿色,长约3mm,先端两侧各具1个紫色斑点。蕊柱足黄绿色带紫红色条纹,疏生毛。药帽白色,长卵状三角形,长约2.3mm,顶端近锐尖且2裂。8.3铁皮石斛与近似种的主要区别铁皮石斛与近似种的主要区别参见附录B。9结果判定9.1形态学结果判定以茎、叶、花的形态特征为依据,符合8.2所描述的形态鉴定特征的,判定为铁皮石斛。9.2分子生物学结果判定送检样品ITS2基因序列结果与铁皮石斛基因序列相似性最高,最大相似度在99%以上,且形态3SN/T5469—2022学兔兔描述的形态鉴定特征的,判定为铁皮石斛。送检样品ITS2基因序列结果与铁皮石斛基因序列相似性低于99%,判定为非铁皮石斛。10标本和样品的保存和处理10.1标本和样品的保存样品应在低温的条件下保存,保存期为1年,以备复验。10.2结果记录与资料保存完整的试验记录包括:样品的来源、种类、时间,试验的时间、地点、方法和结果等,并要有实验人员和审核人员签字。检测需有最终的试验数据、电泳结果照片等。原始数据应归档,妥善保管,以备复验、谈判和仲裁。10.3样品处理保存期满后,样品经灭活后妥善处理。4SN/T5469—2022学兔兔(资料性)铁皮石斛及近似种形态特征图标引序号说明:1-3———细茎石斛Dendrobiummoniliforme(L.)Sw.:1.植株,2.唇瓣正面观,3.药帽正面观;4~6———霍山石斛D.huoshanenseC.Z.TangetS.J.Cheng:4.植株,5.唇瓣正面观,6.药帽正面观;7~9———铁皮石斛D.catenatumLindl.:7.植株,8.唇瓣正面观,9.药帽正面观。图A.1铁皮石斛及近似种形态特征(引自中国植物志)5SN/T5469—2022学兔兔(资料性)铁皮石斛近缘种类群检索表1萼片和花瓣淡黄色、奶黄色至金黄色,除唇瓣外决不带紫色或其他颜色………………………………2萼片和花瓣紫红色、天蓝色、白色或淡黄绿色,有时后来渐转变为淡黄色或乳黄色,先端常染有紫红色…………………………………………………………………………………………………………152茎上部常分枝,叶狭长圆形,宽不及7mm,先端2圆裂……………………细叶石斛D.hancockiiRolfe茎不分枝,叶宽1cm以上,先端锐尖、不裂………………………………………………………33花单生于叶腋,干后蜡质,唇瓣卵状菱形,无任何斑纹………罗河石斛D.lohohenseTang&Wang花通常2至多朵组成总状花序或伞形花序,极罕为单花,干后不为蜡质……………………………44伞形花序几乎无花序柄,唇盘具2个紫红色斑块………………束花石斛D.chrysmnhumWall.&Lindl.总状花序,唇盘不具2个紫红色斑块……………………………………………………………………55茎上下一致的圆柱形,节和节间不肿胀…………………………………………………………………6茎常在中部或中部以上的节间增粗,有时呈纺锤形或稍呈棒状………………………………………116花序出自已落了叶的茎上…………………………………………………………………………………7花序出自带叶的茎中部或中部以上部分,花序柄与茎交成近垂直,花瓣全缘………………………147花序轴长不及5cm,唇瓣边缘具啮蚀状细齿………………………………黄花石斛D.dixanthumRchb.花序轴长10cm以上,唇瓣边缘无啮蚀状细齿或不明显……………………………………………88唇瓣近圆形,凹陷成兜状……………………………………杓唇石斛D.moschatmn(Buch.-Ham.)Sw.唇瓣近圆形,不凹陷成兜状………………………………………………………………………………99花序柄基部被覆着长5mm~20mm套叠的大鞘,花苞片大,舟状,长1.8cm~3cm………线叶石斛D.aurantiacum(F.Muell.)Muell.花序柄基部被覆着长3mm~10mm套叠的小鞘,花苞片小,卵形,长约5mm……………………1010唇瓣圆形,具1个横生的半月形的深紫色斑块,边缘其复流苏………流苏石斛D.fimbriatumHook.唇瓣近圆形,具2个栗色斑块,边缘稍啮蚀状…………………………曲轴石斛D.gibsoniiLindl.11花奶黄色或淡黄色,唇瓣卵状披针形,边缘不具流苏……尖刀唇石斛D.heterocarpumWall.&Lindl.花金黄色,唇瓣非卵状披针形…………………………………………………………………………1212唇瓣近肾形,基部两侧具红色条纹,边缘无流苏………………………短棒石斛D.capillipesRchb.唇瓣非肾形,唇瓣边缘具流苏…………………………………………………………………………1313花瓣边缘密生长流苏,唇瓣近圆形,边缘具复式短流苏……………苏瓣石斛D.harveyanumRchb.花瓣边缘全缘,唇瓣卵状三角形,边缘具很长的流苏…………………长苏石斛D.brymerlanumRchb.14花序具2朵~7朵花,唇瓣金黄色,