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ICS67.050CCSC53中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T5439.3—2022出口食品中食源性致病菌快速检测方法PCR-试纸条法第3部分:副溶血性弧菌RapiddetectionoffoodbornepathogensfromexportedfoodbyPCR-Lateralflowdipstickmethod—Part3:VibrioParahemolyticus2022-03-14发布2022-10-01实施中华人民共和国海关总署发布前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件是SN/T5439的第3部分。SN/T5439已经发布了以下部分:———第1部分:沙门氏菌;———第2部分:金黄色葡萄球菌;———第3部分:副溶血性弧菌;———第4部分:克罗诺杆菌;———第5部分:产志贺毒素大肠埃希氏菌及大肠埃希氏菌O157;———第6部分:空肠弯曲菌;———第7部分:单核细胞增生李斯特氏菌。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国南京海关、南京农业大学、中华人民共和国上海海关、中华人民共和国福州海关、合肥工业大学、苏州蝌蚪生物技术有限公司、广东省科学院微生物研究所、广东环凯生物科技有限公司、中华人民共和国合肥海关、杭州傲敏生物科技有限公司。本文件主要起草人:薛峰、曾德新、郭菁、蒋原、陈伟、雷涛、庞锐、曲晓莹、戴建君、苏静、陆寿祥、申进玲、汤芳、余晓峰、凌南。ⅠSN/T5439.3—2022出口食品中食源性致病菌快速检测方法PCR-试纸条法第3部分:副溶血性弧菌1范围本文件规定了出口食品中食源性致病菌-副溶血性弧菌快速检测的PCR-试纸条方法。本文件适用于出口食品中副溶血性弧菌的定性检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB4789.7—2013食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403—2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。副溶血性弧菌VibrioParahaemolyticus其是一种嗜盐性的革兰氏阴性菌,棒状、弧状、卵圆状无芽孢菌,属于弧菌属,是一种常见的病原菌。4缩略语下列缩略语适用于本文件。DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonuleicacid)dNTP:脱氧核苷酸三磷酸(deoxyribonuleosidetriphosphate)EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)FITC:异硫氰酸盐(fluorescein5-isothiocyanate)Tris:三羟甲基氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane]5方法原理对样品中副溶血性弧菌进行增菌培养后提取DNA,采用上游和下游引物分别经地高辛和异硫氰酸盐标记的副溶血性弧菌的特异性检测引物进行PCR扩增。检测用试纸条上含有金标记的抗异硫氰酸盐的抗体,可与PCR产物上的异硫氰酸盐标记分子结合,在检测线位置上有抗地高辛抗体,可与PCR产物上的地高辛标记分子结合,从而显色。如模板未扩增,则无PCR产物与地高辛抗体及FITC抗体结合,从而不能在检测线(T线)位置显示颜色。1SN/T5439.3—20226试剂和材料除另有规定外,试剂为分析纯或生化试剂,实验用水符合GB/T6682的要求。6.1引物副溶血性弧菌扩增引物详见表1,靶基因序列参见附录A。表1试验用引物致病菌种类引物序列(5'→3')5’端标记物靶基因片段长度副溶血性弧菌F:5’-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3’地高辛R:5’-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3’异硫氰酸盐toxR367bp6.2试剂6.2.1DNA提取液:20mmoL/LTris-HCl,2mmol/LEDTA,1.2%TritonX-100(pH8.0)。6.2.22×PCR预混液。6.2.3PCR引物。6.2.4试纸条:通过采购的原料试剂自行组装(参见附录B),或采用等效的商品化试纸条。6.2.5展开液:10mmol/LTris、1%BSA、1%(体积分数)Tween20以及浓度为0.05mol/L的NaOH;或采用等效的商品化产品。7仪器设备7.1离心机:离心力≥12000g。7.2微量移液器:100μL~1000μL,20μL~200μL,0.5μL~10μL。7.3PCR仪。7.4恒温水浴锅:100℃±1℃。7.5天平:感量0.01g。7.6pH计。7.7核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。8检验步骤8.1样品制备和增菌按照GB4789.7—2013的方法进行样品制备和增菌。8.2样品DNA提取8.2.1增菌液模板DNA的制备对于8.1获得的增菌液,采用如下方法制备模板DNA:a)吸取1mL菌液加入1.5mL离心管中,12000g离心3min,弃上清;b)加入1mL0.85%无菌生理盐水,完全溶解沉淀,12000g离心3min,弃上清;2SN/T5439.3—2022c)加入100μLDNA提取液混匀后沸水浴10min,置冰上冷却;d)12000g离心2min,上清液即为模板DNA。也可采用等效的商品化核酸提取试剂盒并按其说明提取核酸。8.2.2可疑菌落模板DNA的制备对于8.1分离到的可疑菌落,可直接挑取可疑菌落再按照8.2.1c)步骤制备模板DNA以待检测。也可采用等效的商品化核酸提取试剂盒并按其说明提取核酸。8.3DNA浓度和纯度的测定取5μLDNA溶液加双蒸水稀释至1mL,使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值A260和A280。DNA的浓度按公式(1)计算:c=A×N×50/1000………………(1)式中:c———DNA浓度,单位为纳克每微升(ng/μL);A———260nm处的吸光值;N———核酸稀释倍数。当A260/A280比值在1.7~1.9之间时,适宜于PCR扩增。8.4PCR扩增8.4.1PCR反应体系见表2。表2PCR反应体系组分总体积(30μL)2xPCR预混液15μL上游引物(10μmol/L)1μL下游引物(10μmol/L)1μLDNA模板a10μL无菌水3μLaDNA模板的浓度限定在10pg/μL~10ng/μL之间。8.4.2反应条件94℃预变性5min;94℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸1min,35个循环后进入72℃,7min;4℃保存。检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。用副溶血性弧菌DNA模板作阳性对照,用非副溶血性弧菌DNA模板作阴性对照,用等体积的无菌水代替模板DNA作空白对照。8.4.3试纸条检测取6μLPCR产物,加入54μL上样稀释液,混匀后垂直缓慢滴加于试条样品垫中,3min观察结果。3SN/T5439.3—20229质量控制以下条件有一条不满足时,实验视为无效:a)空白对照:质控线变红,检测线未变红;b)阴性对照:质控线变红,检测线未变红;c)阳性对照:质控线变红,检测线变红。10结果判断与表述10.1结果判定试纸条质控线变红色,且检测线变红色,PCR扩增产物为可疑阳性。可疑阳性产物经测序进行确证。试纸条质控线变红色,检测线不变色,PCR扩增产物为阴性。10.2表述PCR产物试纸条检测为可疑阳性,同时测序结果正确者,继续按照传统方法进行分离,若确分离到该菌,判为含副溶血性弧菌,表述为检出副溶血性弧菌;PCR产物试纸条检测为阴性,判为不含有副溶血性弧菌,表述为未检出副溶血性弧菌。11检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403—2008中附录D的规定执行。12废弃物处理检测过程中的废弃物,收集后在焚烧炉中焚烧处理。13检出限本文件所规定方法的最低检出限(LOD)为102CFU/mL。4SN/T5439.3—2022附录A(资料性)PCR产物测序结果副溶血性弧菌的基因扩增靶标参考序列(gennbank号:KF993356.1)如下所示。GTCTTCTGACGCAATCGTTGAACCAGAAGCGCCAGTAGTACCTGAAAAAGCACCTGTGGCTTCTGCTGTGAACCCTTGGATTCCACGCGTTATTTTATTTTTGGCACTATTACTACCGATTTGCGTACTGCTGTTTACAAACCCAGCGGAATCTCAGTTCCGTCAGATTGGTGAGTATCAGAACGTACCAGTGATGACACCTGTAAATCACCCGCAAATCAACAACTGGTTGCCTTCTATTGAGCAGTGCATTGAACGCTACGTTAAACACCATGCAGAAGACTCGTTACCAGTGGAAGTAATTGCCACTGGCGGACAAAATAACCAGCTGATTTTGAACTACATTCATGACAGCAACCACTCGTAT5SN/T5439.3—2022附录B(资料性)含有金标记的抗FITC的单克隆抗体和固定有地高辛抗体的通用核酸检测试纸条B.1组成成分B.1.1地高辛抗体。B.1.2羊抗鼠二抗。B.1.3FITC抗体。B.1.41mol/LTris-HCl(pH=8.0)。B.1.510%蔗糖溶液。B.1.60.1mol/L碳酸钾(K2CO3)溶液。B.1.71%柠檬酸三钠溶液。B.1.80.2mol/L磷酸盐缓冲液(PB)。B.1.910%牛血清白蛋白(BSA)溶液。B.1.10金标垫处理液:蔗糖、吐温-20、海藻糖、PEG2000和0.01mol/LPB(pH7.4)。B.1.11样品垫处理液:曲拉通-100、NaCl、Tris-HCl(PH8.0)和0.01mol/LPB(pH7.4)。B.1.12聚酯膜。B.1.13硝酸纤维膜(NC膜)。B.1.14吸水纸。B.1.15PVC底板。B.2试纸条结构见图B.1。标引序号说明:1———吸水滤纸垫;2———结合物垫,附有FITC抗体与胶体金颗粒的交联体;3———侧向层析基质(硝酸纤维素膜);4———检测带,附有地高辛抗体;5———质控带,附有羊抗鼠二抗;6———衬底;7———吸水垫。图B.1试纸条结构6SN/T5439.3—2022B.3试纸条的制备B.3.1试纸条材料准备B.3.1.1制金:利用柠檬酸三钠作为还原剂把氯金酸还原为单质金的方法制备金纳米粒子。准备干净的锥形瓶和搅拌子,向锥形瓶中加入双蒸水和氯金酸并置于磁力加热搅拌器上加热,待瓶中液体沸腾后,加入柠檬酸三钠溶液(最好现配现用),边继续加热边搅拌,直到瓶内液体状态变为透明的酒红色,即为制得的金纳米粒子(需质控金纳米粒子粒径为15nm~40nm),关闭热源后继续搅拌5min至液体保持为透明酒红色不变后停止,取下锥形瓶待冷却后取出搅拌子,金纳米粒子置于2℃~8℃保存备用。B.3.1.2金标垫制作:聚酯膜裁切成(65mm~75mm)×300mm(宽×长)的预处理膜于金标处理液中浸泡2h,再取出烘干备用。B.3.1.3样品垫制作:聚酯膜板裁切成17mm×300mm(宽×长)长条于样品垫处理液中浸泡2h,再取出放置烘箱中烘干备用。B.3.1.4吸水垫制作:将纸板用定位裁切机裁切19mm×300mm(宽×长)长条备用。B.3.1.5胶体金标记FITC抗体:取上述制备的1mL胶体金经K2CO3溶液调节pH后,加入FITC抗体工作液,充分混匀后置于室温振荡反应1h,再向溶液中加入10%的BSA溶液继续振荡反应30min,9800r/min4℃离心10min,沉淀重悬于BSA溶液中2℃~8℃保存备用。B.3.1.6喷金:利用喷金划膜仪将上述制备好的金标记抗体的重悬液喷至准备好的金标垫上(最终每个金标垫上的金标抗体重悬