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ICS65.020.30CCSB41中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1247—2022代替SN/T1247—2007猪繁殖与呼吸综合征检疫技术规范Quarantineprotocolforporcinereproductiveandrespiratorysyndrome2022-07-07发布2023-02-01实施中华人民共和国海关总署发布学兔兔—2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件参考世界动物卫生组织(OIE)《陆生动物诊断试验和疫苗手册》(2021版)3.9.6章起草,一致性程度为非等效。本文件代替SN/T1247—2007《猪繁殖和呼吸综合征检疫规范》,与SN/T1247—2007相比主要技术变化如下:———文件名称修改为《猪繁殖与呼吸综合征检疫技术规范》;———增加了实时荧光反转录聚合酶链式反应试验方法(检测PRRSV通用型、美洲株和欧洲株);———增加了附录C。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国大连海关、中华人民共和国成都海关、大连工业大学、中华人民共和国南京海关、中华人民共和国拱北海关、中华人民共和国沈阳海关、中华人民共和国兰州海关、中华人民共和国农业科学院特产研究所、上海大学。本文件主要起草人:贾赟、孙颖杰、万超、胡传伟、姜焱、徐博文、张素芳、陈沁、耿庆华、刘钊、徐超、孙晓飞、简中友、袁文泽等。本文件的历次版本发布情况为:本文件于2007年首次发布,本次为第一次修订。ⅠSN/T1247—2022学兔兔范围本文件规定了猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的临床诊断、病毒分离鉴定、免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)、间接免疫荧光试验(IFA)、间接酶联免疫吸附试验(间接ELISA)、反转录-聚合酶链式反应试验(RT-PCR)、实时荧光反转录-聚合酶链式反应试验(RealtimeRT-PCR)诊断方法。本文件适用于猪繁殖与呼吸综合征的检疫、监测和诊断。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文本中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,凡是注日期的引用文件,仅该日期的版本适用于本文件;凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4缩略语下列缩略语适用于本文件。PRRS猪繁殖与呼吸综合征PRRSV猪繁殖与呼吸综合征病毒CPE致细胞病变效应PBS磷酸盐缓冲盐水IPMA免疫过氧化物酶单层试验IFA间接免疫荧光试验HRP辣根过氧化物酶RT-PCR反转录聚合酶链式反应RealtimeRT-PCR实时反转录聚合酶链式反应RNA核糖核酸DEPC焦碳酸二乙酯Taq酶TaqDNA聚合酶dNTP脱氧核苷三磷酸bp碱基对EB溴化乙锭1SN/T1247—2022学兔兔临床诊断急性感染初期,猪群表现为食欲低下、发热、昏睡和精神不振等症状,个别猪可出现双耳、外阴、腹部、口部青紫发绀,一般持续1周~3周;发病高峰的主要特征是母猪早产、流产、胎儿自溶和木乃伊胎及弱仔增多;仔猪断奶前死亡率增加,高峰期一般持续8周~12周;发病末期,母猪繁殖功能逐渐恢复,达到或接近病前水平。育肥猪存在不同程度呼吸系统症状,痊愈猪一般生长缓慢,体重较轻。若没有继发感染,出生前后感染的仔猪,呼吸困难、急促,同时出现眼周及眼睑水肿、结膜炎、蓝耳、食欲不振、发热、皮肤红斑、腹泻、震颤、毛发粗乱、厌食和神经症状。断乳仔猪感染PRRSV的典型临床症状表现为发热、肺炎、昏睡及精神萎靡,如果伴发细菌感染,则死亡率显著升高。剖检病死猪,可见间质性肺炎并伴有卡他性肺炎和肺水肿等特征病变,其他脏器一般不表现肉眼可见病变。可引起所有年龄段猪的高烧(40℃~42℃)。有以上临床症状者,可以怀疑猪群有猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染,确诊需要实验室检验。6病毒分离鉴定6.1材料准备6.1.1器材二氧化碳培养箱、普通冰箱及低温冰箱、倒置生物显微镜、恒温水浴箱、离心机及离心管、96孔细胞培养板、微量移液器、组织研磨器、孔径0.2μm的微孔滤器及滤膜。6.1.2试剂RPMI1640细胞培养液、MEM细胞培养液、犊牛血清、青霉素(104IU/mL)与链霉素(104μg/mL)溶液、7.5%碳酸氢钠溶液等。试验用水应符合GB/T6682要求。6.1.3细胞猪原代肺泡巨噬细胞培养物(PAM)、MARC-145。PAM由未感染过PRRS猪群中6周龄~8周龄的猪获取,并经批次检验合格,制备和检验方法按照附录A执行。6.1.4样品6.1.4.1采样无菌采取扁桃体、肺、淋巴结和脾等组织,血清或腹水置低温保存盒内立即送检。不能立即检测者,应放-20℃冰箱中,长期保存应置于-70℃冰箱中。6.1.4.2制备血清和腹水可直接检测。肺、脾和扁桃体等组织可单独检测,也可混合后检测。各组织剪碎后研磨成糊状,加入RPMI1640,制成10%的组织悬液,3000r/min离心15min,吸取上清液,加入青霉素500IU/mL、链霉素500μg/mL、庆大霉素500μg/mL和两性霉素B200μg/mL。怀疑有细菌污染的样品,也可用0.2μm微孔滤膜过滤处理。2SN/T1247—2022学兔兔细胞,先将PAM细胞用RPMI1640稀释(含犊牛血清5%,青霉素100IU/mL、链霉素100μg/mL、庆大霉素50μg/mL、两性霉素B10μg/mL,pH7.2),稀释细胞终浓度为每毫升1×106个细胞。或将MARC-145用MEM稀释,使细胞终浓度为每毫升5×104个细胞。然后,每孔100μL加入96孔细胞培养板中。6.2.2稀释样品在空白96孔细胞培养板中加入细胞培养液RPMI1640,每孔90μL,在A排和E排各孔内分别加入样品,每孔10μL(样品1∶10稀释),将板轻轻摇动后,从A和E排孔各取10μL分别移入B和F排孔内(样品1∶100稀释)。将板轻轻摇动后,从B和F排孔各取10μL分别移入C排和G排孔内(样品1∶1000稀释),将板轻轻摇动后,从C排和G排孔各取10μL分别移入D排和H排孔内(样品1∶10000稀释)。每个培养板应设置空白对照。振动稀释板后加盖,置4℃冰箱内保存备用。6.2.3接种样品分别吸取上述稀释样品50μL接种于6.2.1中对应的细胞孔(第一代)中,放入37℃、5%二氧化碳培养箱中培养,每天观察CPE,连续观察2d。6.2.4培养物盲传一般在第一代培养2d后,不论有无细胞病变,一律将每孔内细胞液取25μL,整板移入按照6.2.1方法制备的新细胞板对应的孔内。37℃、5%二氧化碳培养箱中培养2d~5d,每天观察CPE。6.3结果判定通常在接种1d~2d后可出现CPE,主要呈现细胞圆缩、聚集、固缩,最后溶解脱落。初次接种样品和盲传后都出现CPE,或盲传后出现CPE,经PCR或荧光PCR检测呈阳性结果的认定为阳性。仅初次接种样品出现CPE,PCR呈阴性结果的认定为是由于病料毒性引起的假阳性。在细胞培养物盲传结束后,不论是否出现CPE,对所有的孔必须采用免疫过氧化物酶单层试验(IP-MA)或间接免疫荧光试验(IFA)进行终判;只要对PRRSV标准阳性血清呈现阳性反应,则被认定为PRRSV分离阳性。7免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)7.1材料准备7.1.1器材微量移液器、倒置显微镜等。7.1.2试剂7.1.2.1IPMA诊断板的制备:按照A.6执行。7.1.2.2标准阳性血清、标准阴性血清和兔抗猪IgGHRP结合物均由国家指定单位提供。使用前按说明书规定用血清稀释液稀释至工作浓度。7.1.2.3洗涤液、血清稀释液和显色/底物溶液按照附录B配制。试验用水应符合GB/T6682要求。3SN/T1247—2022学兔兔样品采集被检猪血液,分离血清,血清应新鲜、透明、不溶血、无污染,密装于灭菌小瓶内,被检血清统一编号,立即送检,当天送检于4℃保存,24h以后送检的于-20℃冰箱保存。7.2操作方法7.2.1稀释血清样品:在空板的A排和E排各孔分别加入180μL的血清稀释液,其余各孔加120μL。将20μL被检血清和对照血清分别加入A排和E排各孔,缓慢摇动,从A排和E排各孔内取40μL分别加入B排和F排,依次做1∶40、1∶160、1∶640稀释。7.2.2取上述板中稀释血清样品各50μL加入IPMA诊断板的相应孔内,封板,37℃孵育1h,弃去液体,用0.15mol/mLNaCl+0.5%吐温-80洗板3次。7.2.3用0.15mol/LNaCl和0.5%吐温-80稀释兔抗猪IgGHRP结合物为工作浓度,加入50μL结合物稀释液于板中,封板后37℃孵育1h,洗涤3次。7.2.4各孔中加入显色剂/底物(AEC)溶液50μL,在18℃~22℃室温下作用至少30min,弃去液体,加入50μL0.05mol/L醋酸钠溶液。7.3结果判定将IPMA诊断板置于倒置显微镜下判读。在阴、阳性对照样品都成立的前提下,被检血清标本板内各孔约30%~50%的细胞质呈现深红色,判读为免疫过氧化物酶单层试验阳性,记作IPMA(+);细胞质未被染色,判读为免疫过氧化物酶单层试验阴性,记作IPMA(-)。血清非特异性反应使整孔细胞染色(与阳性对照比较)。血清滴度以50%以上的孔染色的最高稀释度的倒数表示。血清滴度10为阴性,10或40为弱阳性,非特异性染色常在此范围内,滴度≥160为阳性。8间接免疫荧光试验(IFA)8.1材料准备8.1.1器材荧光显微镜、二氧化碳培养箱、恒温箱、保湿盒、微量移液器等。8.1.2试剂8.1.2.1IFA诊断板的制备:按照附录A.7执行。8.1.2.2兔抗猪IgG异硫氰酸荧光素(FITC)结合物、标准阳性血清和标准阴性血清,由国家指定单位提供。8.1.3样品被检血清应新鲜、透明、不溶血、无污染,试验前用PBS液作20倍稀释。8.2操作方法8.2.1在96孔板中每孔加入PBS液190μL,再分别加入待检血清、阳性血清、阴性血清10μL(1∶20稀释)。8.2.296孔板IFA操作步骤如下。取96孔IFA诊断板,加入150μLPBS,室温浸润5min,弃去板中液体,并在吸水纸上轻轻拍干。4SN/T1247—2022学兔兔中稀释的血清,封板后,湿盒中37℃作用30min,弃去板中血清,在吸水纸上轻轻拍干。每孔加入PBS液200μL,洗板6次,弃去液体。每孔加入工作浓度的兔抗猪IgGFITC结合物50μL,在37℃湿盒中作用30min。弃去板中结合物,用PBS洗涤4次后,最后在吸水纸上轻轻拍干。用荧光显微镜观察。8.3结果判定在对照血清成立的前提下进行,即标准阳性血清对照中感染细胞孔应出现典型的特异性荧光,而未感染细胞孔不出现荧光;标准阴性血清对照感染细胞孔和未感染细胞孔均不出现荧光。被检血清中未感染细胞孔不出现荧光,感染细胞孔出现绿色荧光,判定为阳性;未感染细胞和感染细胞中都没有特异性绿色荧光,判定为阴性。任何血清在1∶20稀释条件下出现可疑结果时应重新检测,或2周~3周后重新采样进行检测,重复检测仍为可疑,判定为阳性。9间接酶联免疫吸附试验(间接ELISA)9.1材料准备9.1.1器材96孔平底微量反应板、微量移液器、酶标测定仪、恒温箱、保湿盒等。9.1.2试剂9.1.2.1PRRSV抗原和正常细胞对照抗原、兔抗猪IgGHRP结合物(以下简称“酶标抗体”)、标准阳性血清和标准阴性血清,由国家指定单位提供。使用前按说明书规定用抗原稀释液