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ICS65.020.01CCSB16中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T5550—2022土壤中检疫性真菌的分离、培养方法Methodsforisolation,cultivationofquarantinefungiinsoil2022-07-07发布2023-02-01实施中华人民共和国海关总署发布学兔兔—2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:武汉海关技术中心、中华人民共和国南京海关、中华人民共和国青岛海关、中国质量认证中心武汉分中心。本文件主要起草人:王振华、张春亚、彭超、梁昊、李彬、王琴、叶芸、徐雪、郑剑、王英超。ⅠSN/T5550—2022学兔兔标准下载土壤中检疫性真菌的分离、培养方法1范围本文件明确了土壤中检疫性真菌的分离、培养方法。本文件适用于进出境植物及其产品、集装箱携带的土壤和田间疫情监测的土壤中检疫性真菌的分离、培养。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注明日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T1102出入境集装箱检验检疫规程SN/T1131大豆疫霉病菌检疫鉴定方法SN/T1158进出境植物盆景检疫规程SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1土壤soil在地球表面生物、气候、母质、地形、时间等因素综合作用下所形成的能够生长绿色植物,具有生态环境调控功能、处于永恒变化中的疏松矿物质与有机质的混合物。3.2土壤悬浮液soilsuspension将样品土壤与定量的无菌水混合,反复振荡后得到的混合液。3.3稀释倒平板法pourplatemethod将待分离的土壤用无菌水作一系列的稀释,分别取不同稀释液少许至灭菌的培养皿中,再往培养皿中倒入已溶化并冷却至45℃左右的琼脂培养基,混匀,待琼脂凝固后,进行保温培养的方法。3.4选择性培养基selectivemedium进行植物病原菌分离培养时,为促进目标菌落的形成,抑制其他非目标菌的生长,在培养基中添加不同的碳源、氮源或抑制性物质而形成的具有一定选择能力的培养基。4仪器设备和主要试剂4.1仪器设备超净工作台、高压灭菌器、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、恒温水浴锅、体视显微镜、生物显微1SN/T5550—2022学兔兔标准下载镜(带显微照相装置)、天平(感量0.1g)、测微尺、微量移液器及枪头、光照培养箱等。4.2主要试剂和培养基4.2.1试剂玉米粉、马铃薯、葡萄糖、琼脂粉、Difco玉米粉琼脂、氯霉素、新霉素、链霉素、氯四环素、金霉素、氨苄青霉素钠盐、匹马霉素、硫酸链霉素、万古霉素、利福平、利福平钠盐、苯菌灵、恶霉灵、五氯硝基苯、蛋白胨、牛胆汁、磷酸二氢钾(KH2PO4)、磷酸氢二钾(K2HPO4)、七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)、硫酸镁(无水)、多半乳糖醛酸、孟加拉红、麦芽膏粉、松膏、蛋白胨、酵母膏、V8蔬菜汁、番茄汁、胡萝卜、黑麦、牛肉膏、碳酸钙、β-谷甾醇、色氨酸、氯化钙、硫氨、氯化钾、乙二胺四乙酸铁钠、L-天门冬酰胺、L-山梨糖、牛胆盐、四硼酸钠。除另有规定外,所有试剂均为分析纯。4.2.2培养基马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、孟加拉红琼脂培养基、麦芽汁琼脂培养基(MEA)、玉米粉琼脂培养基(CMA)、松膏培养基、马丁氏培养基、V8培养基、番茄汁培养基、胡萝卜丝培养基(CPA)、黑麦番茄汁琼脂培养基、加抗菌素黑麦番茄汁琼脂培养基、镰孢属选择性培养基、轮枝孢菌属选择性培养基、疫霉属选择性培养基、卵孢子培养基(参见附录A)。5取样及接收样品5.1取样根据文件SN/T1102、SN/T1131、SN/T1158和SN/T2122针对性地对土壤进行检查和取样。在田间进行疫情监测时,采用五点取样法采集土壤样品,每一取样点除去地面的枯枝落叶等杂物,铲去地表1cm~2cm的土层,挖10cm×10cm×15cm土壤,混合后取500g,晾干后粉碎,过100目筛。填写相关记录单(如:采样时间、地点、数量、采样人等信息)。5.2样品传递土壤样品放在耐受性好、密闭、防渗漏的样品袋中。在样品袋外部要贴有标签(样品编号、货物名称、取样部门、取样时间等信息),低温(4℃~10℃)保存和运输样品,防止可能含有的有害生物逃逸、扩散,确保样品真实、安全、及时传递到实验室。随检样品应附有送检单,送检单应与样品分开放置。对运输样品的运输工具需要进行消毒处理。5.3样品接收核对样品与送检单,检查包装容器及样品的破损情况,有无污染,对不符合要求的应重新取样,填写样品接收单。待检土壤置于4℃冰箱保存,在1个月内分离完样品。6土壤中检疫性真菌分离方法6.1土壤中检疫性真菌的种类土壤中检疫性真菌的种类较多,主要包括腐霉菌属、腥黑粉菌属、疫霉菌属、镰孢属、轮枝孢菌属、丝核菌属等真菌(参见附录B)。2SN/T5550—2022学兔兔总则土壤中检疫性真菌常用的分离方法包括稀释平板法、稀释涂布法、诱捕分离法和过筛分离法,还有直接分离法、插入管法、菌丝分离法、孢子悬浮法、湿筛法、漂浮法、土壤淋洗法、蒸汽法、钟形撒粉器法等其他分离方法。土壤中真菌孢子和菌丝体分离的难易程度不同,对各种培养基的适应能力也不同,因此,根据实际情况,可采用多种适宜的分离方法(参见附录C)。6.2.2稀释倒平板法将土壤样品充分混匀后,称取10g土壤加入盛有90mL灭菌水的三角瓶中,将三角瓶置于摇床上110r/min~130r/min,振荡20min~25min,使土壤颗粒均匀分散于灭菌水中,得到稀释10倍的土壤悬浮液,然后用无菌水按10倍进行系列稀释。稀释度以1∶10000较适宜。取已稀释好的土壤悬浮液1mL与冷却至45℃~50℃的琼脂培养基混匀,倒入灭菌的培养皿中,凝固后将培养皿倒置于培养箱内培养。6.2.3稀释涂布法将土壤样品充分混匀后,称取1.0g土壤加入盛有9mL灭菌水的试管中,将试管置于摇床上110r/min~130r/min,振荡20min~25min,使土壤颗粒均匀分散于灭菌水中,取上清液100μL,涂布含抗生素的培养基平板,25℃±1℃培养。6.2.4诱捕分离法将土壤样品自然风干,碾碎去除杂质,每皿10g~15g土样缓慢加入4mL~7mL无菌水(pH为7.0),使土壤均匀湿润,加盖后用Parafilm膜封口,培养皿倒置24℃、12h光暗交替条件下5d~7d,除去封口膜,打开培养皿,加入含有杀菌剂的无菌水于培养皿中至高出土面约6mm处,加入植物直径为10mm的叶碟,每皿50个,加盖后24℃培养,12h光暗交替条件下24h~48h。6.2.5过筛分离法将土壤样品充分混匀后,称取土壤100g,加水2500mL配成悬浮液,沉降30min后,上部液体用筛(250目)过筛,沉降下来的土壤再悬浮在1000mL水中,沉降30min后过滤。重复进行悬浮和过滤5次~8次,直到上部液体中没有作物残余的颗粒为止。将筛中的草籽、大的土粒、砂粒和木质化组织剔除,把得到的作物残余颗粒放在滤纸上干燥1h,放在琼胶平板上培养。分离用的培养基是水琼胶,用磷酸将酸度调节到pH4.8。水琼胶倒平板后,翻转平板放入培养箱培养72h,除去表面的水层,在平板上等距离加4滴链霉素溶液(浓度是20mg/mL),1h后,在每个加链霉素的地方,放一块过筛到的作物残余颗粒,24℃培养24h~96h。7土壤中检疫性真菌培养方法土壤中检疫性真菌的培养基主要有:马铃薯琼脂培养基(PDA)、孟加拉红琼脂培养基、麦芽汁琼脂培养基(MEA)、松膏培养基、马丁氏培养基、V8培养基、玉米粉琼脂培养基(CMA)、卵孢子培养基等等。分离土壤中植物病原真菌常采用特殊的选择性培养基。25℃~30℃恒温培养箱中培养5d,疫霉属真菌16℃~20℃黑暗培养1周~2周。经分离得到的真菌,可以使用不同的方法进行培养,一般可以挑取单菌落或者稀释纯化法进行纯化培养,以便于对真菌种类进行鉴定。3SN/T5550—2022学兔兔标准下载土壤中检疫性真菌的种类不同,对培养基的要求也不同,因此,最好使用培养真菌的通用培养基,结合使用选择性培养基(参见附录A和附录C)。8样品保存与处理8.1土壤样品的保存与处理样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出检疫性病原真菌的样品应保存于4℃冰箱中,以备复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。8.2分离菌株保存与处理从检测样品中分离并鉴定为检疫性病原真菌的菌株,应妥善保存。将菌株接种于V8培养基或PDA培养基斜面上,20℃~25℃培养5d,然后4℃冰箱保存,或将菌丝块转入20%灭菌甘油并混匀,-80℃长期保存。对不需要长期保存的菌株应及时高压灭菌处理。8.3实验记录与资料保存实验过程中应记录好土壤样品的来源、采集时间、地点、人员和土壤的种类等信息,实验的时间、方法和分离结果等,并要有实验人员和审核人员签字。4SN/T5550—2022学兔兔(资料性)主要培养基A.1马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)A.1.1成分马铃薯(去皮切块)200g葡萄糖20.0g琼脂20.0g氯霉素0.1g蒸馏水1000mLA.1.2制法将马铃薯去皮切块,加1000mL蒸馏水,煮沸10min~20min。用纱布过滤,补加蒸馏水至1000mL。加入葡萄糖和琼脂,加热溶解,分装后,121℃灭菌15min,保存备用。A.2孟加拉红琼脂培养基A.2.1成分蛋白胨5.0g葡萄糖10.0g磷酸二氢钾(KH2PO4)1.0g硫酸镁(无水)0.5g琼脂20.0g孟加拉红0.033g氯霉素0.1g蒸馏水1000mLA.2.2制法上述各成分加入蒸馏水中,加热溶解,补足蒸馏水至1000mL,分装后,121℃灭菌15min,避光保存备用。A.3麦芽汁琼脂培养基(MEA)A.3.1成分麦芽膏粉130.0g琼脂粉15.0g氯霉素0.1g蒸馏水1000mLA.3.2制法上述各成分加入蒸馏水中,加热溶解,分装后,121℃灭菌15min,保存备用。5SN/T5550—2022学兔兔~18.0g葡萄糖10.0g蛋白胨5.0g酵母膏2.0g牛肉膏1.0g琼脂20.0g蒸馏水1000mLA.4.2制法松膏单独溶解后再与上述各成分加入蒸馏水中,加热溶解,分装后,121℃灭菌15min,保存备用。A.5马丁氏培养基A.5.1成分K2HPO41.0gMgSO4·7H2O0.5g葡萄糖10.0g蛋白胨5.0g琼脂18.0g蒸馏水1000mL孟加拉红溶液(1%)3.3mL1%链霉素3.0mLA.5.2制法上述各成分加入蒸馏水中,加热溶解,分装后,121℃灭菌15min,保存备用。A.6V8培养基A.6.1成分V8蔬菜汁100mL碳酸钙0.2g琼脂粉15.0g~20.0g去离子水900mLA.6.2制法上述各成分加入蒸馏水中,加热溶解,补足蒸馏水至1000mL,分装后,121℃灭菌20min,保存备用。A.7番茄汁培养基A.7.1成分番茄汁100mL6SN/T5550—2022学兔兔~20.0g去离子水900mLA.7.2制法上述各成分加入蒸馏水中,加热溶解,补足蒸馏水至1000mL,分装后,121℃灭菌20min,保存备用。A.8胡萝卜丝培养基CPAA.8.1成分胡萝卜丝50.0g琼脂粉15.0g蒸馏水1000mLA.8.2制法上述各成分加入蒸馏水中,加热溶解,补足蒸馏水至1000mL,分