SNT 5486-2022 塞内卡病毒病检疫技术规范

ICS65.020.30CCSB41中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T5486—2022塞内卡病毒病检疫技术规范Quarantineprotocolforinfectionwithsenecavirus2022-07-07发布2023-02-01实施中华人民共和国海关总署发布学兔兔标准下载目次前言Ⅱ…………………………………………………………………………………………………………1范围1………………………………………………………………………………………………………2规范性引用文件1…………………………………………………………………………………………3术语和定义、缩略语1………………………………………………………………………………………3.1术语和定义1…………………………………………………………………………………………3.2缩略语1………………………………………………………………………………………………4试剂与材料1………………………………………………………………………………………………5设备2………………………………………………………………………………………………………6病毒分离与鉴定3…………………………………………………………………………………………6.1样品采集和处理3……………………………………………………………………………………6.2接种及观察3…………………………………………………………………………………………6.3培养物鉴定3…………………………………………………………………………………………7RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法4………………………………………………………………7.1样品采集4……………………………………………………………………………………………7.2样品制备4……………………………………………………………………………………………7.3RNA提取4……………………………………………………………………………………………7.4RT-PCR检测4………………………………………………………………………………………7.5实时荧光RT-PCR检测5……………………………………………………………………………8病毒中和试验5……………………………………………………………………………………………8.1病毒繁殖5……………………………………………………………………………………………8.2毒价测定5……………………………………………………………………………………………8.3中和试验程序5………………………………………………………………………………………8.4试验成立条件6………………………………………………………………………………………8.5结果判定6……………………………………………………………………………………………9间接ELISA6………………………………………………………………………………………………9.1样品采集制备6………………………………………………………………………………………9.2检测步骤6……………………………………………………………………………………………9.3结果判定7……………………………………………………………………………………………10综合判定7…………………………………………………………………………………………………附录A(规范性)病毒分离用试剂的配制8………………………………………………………………附录B(规范性)RT-PCR用试剂的配制9………………………………………………………………附录C(资料性)PCR扩增产物参考序列10………………………………………………………………附录D(资料性)病毒半数细胞培养感染量(TCID50)的计算(Karber法)11…………………………附录E(规范性)ELISA用试剂的配制12…………………………………………………………………ⅠSN/T5486—2022学兔兔—2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国深圳海关、云南省武定县动物疫病预防控制中心、湖南普简生物科技有限公司、深圳市检验检疫科学研究院、深圳技术大学、中华人民共和国上海海关。本文件主要起草人:林彦星、花群俊、黄超华、史卫军、曹琛福、杨俊兴、贾鹏、张强、金业、吴江、林永涛。ⅡSN/T5486—2022学兔兔范围本文件规定了塞内卡病毒分离鉴定、反转录聚合酶链式反应、实时荧光反转录聚合酶链式反应、病毒中和试验和酶联免疫吸附试验的技术要求。本文件适用于塞内卡病毒病的检疫和流行病学调查。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出入境动物检疫采样GB19489实验室生物安全通用要求3术语和定义、缩略语3.1术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。3.2缩略语下列缩略语适用于本文件。BSA:bovineserumalbumin,牛血清白蛋白。CPE:cytopathicEffect,细胞病变。Ct值:cyclethreshold,阈值。DEPC:diethylpyrocarbonate,焦碳酸乙二酯。EDTA:ethylenediaminetetraaceticacid,乙二胺四乙酸。ELISA:enzyme-linkedimmunosorbentassay,酶联免疫吸附试验。HRP:horseradishperoxidase,辣根过氧化物酶。OD值:opticaldensity,光密度值。PBS:phosphatebufferbaline,磷酸盐缓冲溶液。RT-PCR:reversetranscription-polymerasechainreaction,反转录聚合酶链反应。TCID50:50%tissuecultureinfectivedose,半数细胞培养感染。TMB:3,3’,5,5’-tetramethy-benzidine,四甲基联苯胺。4试剂与材料4.1水:符合GB/T6682所规定的一级水。1SN/T5486—2022学兔兔乙醇。4.3pH7.4、0.01mol/LPBS:配制方法应符合附录A的规定。4.4双抗及双抗储存液:配制方法应符合附录A的规定。4.5细胞生长液、细胞维持液、细胞消化液:配制方法应符合附录A的规定。4.6胎牛血清。4.7猪肾传代细胞(PK-15)。4.8DEPC水应符合附录B的规定,推荐使用商品化DEPC处理的无RNA酶的水。4.9病毒裂解液TRIzol。4.10异丙醇:分析纯,使用前于-18℃预冷。4.11氯仿:分析纯。4.1270%乙醇:用DEPC水和无水乙醇配制,使用前于-18℃预冷。4.13RT-PCR试剂盒。4.14RT-PCR引物:10μmol/L。根据塞内卡病毒VP1基因序列设计,扩增长度为372bp。———上游引物F1:5'-ATCAGACCTTGAAGTCACGGTG-3'———下游引物R1:5'-GCGTTCTTGTACCGAACGTAC-3'4.1550×TAE缓冲液、1.5%琼脂糖凝胶、10×电泳上样缓冲液:配制方法应符合附录B的规定。4.16DNA分子量标准。4.17实时荧光RT-PCR试剂盒。4.18实时荧光RT-PCR引物和探针:10μmol/L。根据塞内卡病毒3D基因序列设计,扩增长度为74bp。———上游引物F2:5'-CCAACAAGGGTTCCGTCTTC-3'———下游引物R2:5'-TTGGACGAATTTGCGTTTTAGA-3'———探针P:5'-FAM-CTCCGACTTCCTCTCTCTCCGATGCTGT-BHQ1-3'4.19塞内卡病毒衣壳蛋白重组抗原。4.20标准阳性血清、标准阴性血清、标准塞内卡病毒。4.21HRP标记的兔抗猪IgG。4.22包被液、洗涤液、封闭液、稀释液、底物显色液及终止液:配制方法应符合附录E的规定。5设备5.1采样用具:剪刀、镊子、注射器、1.5mL离心管、10mL离心管、研钵。采样工具必须经121℃±2℃、15min高压灭菌并烘干。5.2二级生物安全柜、高速冷冻离心机(离心速度12000r/min以上)、离心机(离心速度3000r/min)、漩涡振荡器、微量可调移液器(10μL、100μL、1000μL)及配套带滤芯吸头、冰箱(2℃~8℃、-18℃和-70℃)。5.3细胞培养瓶(或培养板)、96孔细胞培养板、吸管(5mL和10mL)、洗耳球或电动助吸器、CO2培养箱、倒置显微镜。5.4普通PCR仪、凝胶电泳仪、凝胶成像分析系统、实时荧光PCR仪。5.596孔酶标板、振荡器、恒温培养箱、酶标仪、洗板机。2SN/T5486—2022学兔兔一般要求样品的采集、保存和运输应符合GB/T18088的相关要求。样品的处理应符合GB19489的规定。6.1.2样品的采集6.1.2.1水泡液及水泡皮用75%酒精消毒水泡皮表面,尽量去除污物,用灭菌生理盐水冲洗,去除酒精,然后用无菌注射器穿刺水泡吸取水泡液,置于灭菌管中。采取水泡液后,用无菌手术剪将水泡皮剪下,放入0.01mol/LpH7.4PBS配制的50%甘油缓冲液灭菌管中,加入1%双抗,冷藏送检,24h内送达实验室。6.1.2.2肌肉及组织脏器无菌采集待检样品装入一次性塑料袋或其他灭菌容器,冷藏送检,24h内送达实验室。6.1.2.3全血用无菌方式采集EDTA抗凝全血,密封后冷藏,24h内送达实验室。6.1.3样品的处理6.1.3.1水泡液的处理无菌采集的新鲜水泡液可不做任何处理,直接使用。若水泡液不清洁,则需3000r/min离心5min~10min,并加入双抗。如果水泡液太少,可加入DMEM培养液作适当稀释。6.1.3.2血液的处理反复冻融三次,3000r/min离心10min,取上清液,于-18℃保存备用。6.1.3.3水泡皮和组织样品的处理将采集的水泡皮剪碎,研磨后用0.01mol/L、pH7.4PBS配制成10%的悬液,3000r/min离心10min,取上清液,于-18℃保存备用。6.2接种及观察将处理过的样品上清液经0.22μm无菌针式过滤器过滤后接种已长满单层的PK-15细胞,在37℃含5%CO2培养箱内吸附1h,期间轻摇2次,之后加入细胞维持液,37℃培养。一般24h~48h即可出现CPE。如无CPE则需盲传2代~3代。CPE主要表现为细胞圆缩、团聚,细胞浆颗粒变性、脱落、破裂等变化。6.3培养物鉴定对出现CPE的细胞培养物,用病毒中和试验、RT-PCR或实时荧光RT-PCR进行鉴定。鉴定结果为阳性的,判定为病毒分离阳性,否则判为阴性。对未出现CPE的细胞培养物用病毒中和试验、RT-PCR或实时荧光RT-PCR进行鉴定。鉴定结果为阳性的,需进一步测序,测序结果同源性≥90%的,判3SN/T5486—2022学兔兔标准下载定为病毒分离阳性,否则判为阴性。7RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法7.1样品采集按照6.1.2规定的方法采集样品。7.2样品制备按照6.1.3规定的方法对待检样品进行处理。7.3RNA提取7.3.1于灭菌的1.5mL离心管中加入600μLTRIzol,然后分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各200μL,混匀,再加入200μL氯仿,上下颠倒混匀。于4℃12000r/min离心15min。7.3.2取与7.3.1相同