SNT 5480-2022 虹鳟成分鉴定技术规范 实时荧光PCR法

ICS65.150CCSB50中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T5480—2022虹鳟成分鉴定技术规范实时荧光PCR法Technicalspecificationforrainbowtroutspeciesidentification—real-timePCRmethod2022-07-07发布2023-02-01实施中华人民共和国海关总署发布学兔兔—2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:上海海关动植物与食品检验检疫技术中心、上海科技大学、厦门海关技术中心。本文件主要起草人:蔡一村、王瑛、林颖峥、蒋静、徐淑菲、张强、王鑫杰、薛俊欣、王艳、潘良文、赵简。ⅠSN/T5480—2022学兔兔检测方法。本文件适用于水生动物及其产品中虹鳟物种成分定性检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T5203鱼类物种鉴定基因条形码的检测技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1虹鳟Oncorhynchusmykiss又叫虹鲑、麦奇钩吻鲑,属于鲑科、太平洋鲑属。3.2吉尔大麻哈鱼Oncorhynchusgilae属于鲑科、太平洋鲑属。3.3线粒体DNAmitochondrialDNA,mtDNA线粒体中的遗传物质,线粒体能为细胞产生能量,是在细胞线粒体内发现的脱氧核糖核酸特殊形,与一般位于细胞核内的DNA有不同的演化起源,可能是源自早期细菌。3.4实时荧光PCRReal-timePCR实时荧光定量PCR,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程。Ct值cyclethreshold每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。4缩略语下列缩略语适用于本文件。O.mykiss:虹鳟(oncorhynchusmykiss)。DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonuleicacid)。dNTP:脱氧核苷酸三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphate)。1SN/T5480—2022学兔兔碱基对(basepair)。real-timePCR:实时荧光定量PCR(real-timepolymerasechainreaction)。5试剂与仪器5.1DNA提取试剂或DNA提取试剂盒(参见附录A)。5.2real-timePCR反应配套试剂。5.3蛋白酶K溶液,分析纯。5.470%乙醇,分析纯。5.5TE缓冲液(Tris-Cl、EDTA缓冲液):10mmol/LTris-HCl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0)。5.6引物:用去离子水将每条引物探针配制成100μmol/L储存液,置-20℃以下冻存;使用时取适量配制成10μmol/L工作液,避免多次冻融。序列见表1。特异性序列参见附录B。表1引物探针序列名称引物探针序列(5’—3’)O.mykiss-FAGTAATTATCGGCATACGAAACCAGO.mykiss-RGTTTCGATAATGATCAGTACTGGGATCO.mykiss-PFAM-CTACGGCCGCCCTCGGCCATTTAT-TAMRA6器材与设备高速台式冷冻离心机、实时荧光PCR仪及相关配套设备、NanoDrop微量核酸蛋白测定仪、分析天平、匀浆机、恒温振荡水浴设备、涡旋振荡仪、核酸分析仪、超净工作台、不同量程移液器、离心管等。7取样7.1取样对象主要水生动物及其制品。7.2取样部位宜取鲜活的组织,成鱼宜取但不限于肌肉组织(心、脑、脾、肾、肝、肠、胃等器官也适用),鱼卵取卵膜。如需非致死性取样,剪取部分鳍条或者刮去部分皮肤后取皮下一小块3mm3~5mm3的肌肉块即可。其他水生动物及其制品,例如罐头等,宜取肌肉组织部分,少有脂肪组织。7.3样品预处理样本经过研磨后,称取200mg固体样本或吸取200μL液态样本于2ml离心管中。每个样本取3份,分别标记为检测样品、复检样品和保存样品,加封标记后冷冻保存备用。2SN/T5480—2022学兔兔离心管中,加入600μL裂解液(见附录A)和20μL蛋白酶K溶液(见附录A),混匀,置56℃水浴1h~3h,其间每15min轻微振动混匀;待消化完全,冷却至室温,加入200μL醋酸铵溶液(见附录A),混匀,4℃冷却5min~10min,使蛋白质析出;于4℃,12000g离心10min,上清液转移至另一1.5mL离心管中,于4℃,12000g离心10min,取上清液至另一个洁净1.5mL离心管中,加等体积异丙醇,轻轻摇匀,4℃放置15min;4℃,12000g离心10min沉淀DNA;弃上清,加1mL75%乙醇,轻轻混匀,于4℃,12000r/min离心5min,弃上清,晾干;干燥后加入50μL去离子水溶解;DNA提取液应置冰上备用,若需长期保存应置于≤-20℃保存。也可采用经验证可靠的商业化DNA提取纯化方法或试剂盒进行核酸提取,具体参照说明书使用。8.2DNA浓度和纯度的测定吸取DNA提取液1μL,以去离子水作为空白对照,使用NanoDrop微量核酸蛋白测定仪测定DNA模板的质量浓度及A260/A280比值。DNA的质量浓度根据以下公式计算:DNA的质量浓度=A260×50×稀释倍数(ng/μL)。当A260/A280比值在1.7~1.9之间时,适合于后续PCR扩增。8.3对照和平行设置检测过程中分别设置阳性对照、阴性对照、空白对照。用含目标成分的样品或含目标片段的质粒作为阳性对照,以不含目标成分的样品或不含目标片段的质粒作为阴性对照,以双蒸水为空白对照。样品和对照设置2个平行的反应体系。8.4反应体系在0.2mLPCR反应管中,按表2配制反应体系,加样宜按空白对照、阴性对照、待检样品、阳性对照的次序分别加入模板,盖上管盖,充分混匀。表2real-timePCR实验反应体系试剂a工作液浓度体积MasterMix2×12.5μLO.mykiss-F10μM1μLO.mykiss-R10μM1μLO.mykiss-P10μM0.5μLDNA模板—5μL水—5μLa最终反应体系中试剂添加的种类和总体系体积可能会根据不同的real-timePCR平台产生差异。进行不同re-al-timePCR平台的体系配置时,需要参照不同平台real-timePCR仪说明书,并且需要保证表1中所列组分的终浓度不变。8.5反应程序95℃10min;95℃15s,60℃1min,40个循环。注:根据不同real-timePCR仪器和配套试剂的要求,可以对反应程序中循环(扩增)步骤进行相应等效修改。3SN/T5480—2022学兔兔质量控制以下条件有任一不满足时,实验视为无效:9.1空白对照:荧光通道无荧光信号检出,Ct值≥40.0;9.2阴性对照:荧光通道无荧光信号检出,Ct值≥40.0;9.3阳性对照:荧光通道有荧光信号检出,且出现典型的扩增曲线,Ct值≤35.0。10结果判定10.1在符合第9章的情况下,检测结果按以下进行判定:10.1.1如Ct值≤35.0,则判定为检出虹鳟或吉尔大麻哈鱼成分;10.1.2如Ct值≥40.0,则判定为未检出虹鳟成分;10.1.3如35.0Ct值40.0,则重复一次。如再次扩增后Ct值仍40.0,则判定为检出虹鳟或吉尔大麻哈鱼成分;如再次扩增后Ct值≥40.0,则判定为未检出虹鳟成分。10.2如需要确定物种为虹鳟,可采用SN/T5203进行确认。4SN/T5480—2022学兔兔(规范性)试剂配制A.1裂解液1mol/LTris-HCl(pH8.0)1mL0.5mol/LEDTA1mL0.5mol/LNaCl20mL10%SDS10mL加去离子水定容至100mL。A.2蛋白酶K溶液(20mg/mL)将200mg蛋白酶K加入9.5mL水中,轻轻摇动,直至蛋白酶K完全溶解。不应涡旋混合。加去离子水定容到10mL,然后分装成小份,置于-20℃保存。A.3醋酸铵溶液(7.5mol/L)称取578.12g醋酸铵,加去离子水定容到1L。5SN/T5480—2022学兔兔(资料性)特异性基因序列线粒体基因片段MitochondrialDNAfragment(GenBank:LC050735.1)AGTAATTATCGGCATACGAAACCAGCCTACGGCCGCCCTCGGCCATTTATTGCCTGAAGGAACCCCCGTTCCACTGATCCCAGTACTGATCATTATCGAAAC注:下划线部分分别为上下游引物和探针序列,扩增产物片段102bp。6SN/T5480—2022学兔兔—0845T/NS中华人民共和国出入境检验检疫行业标准虹鳟成分鉴定技术规范实时荧光PCR法SN/T5480—2022*中国海关出版社有限公司出版发行北京市朝阳区东四环南路甲1号(100023)编辑部:[phone]-7530网址中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本880×12301/16印张0.75字数18千字2023年1月第一版2023年1月第一次印刷印数1—500*书号:155175·899定价12.00元学兔兔标准下载