SNT 5488-2022 猪衣原体病检疫技术规范

ICS65.020.30CCSB41中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T5488—2022猪衣原体病检疫技术规范Quarantineprotocolforswinechlamydiosis2022-07-07发布2023-02-01实施中华人民共和国海关总署发布学兔兔—2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件结构和起草规则》的规定起草。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件起草单位:中华人民共和国重庆海关,中华人民共和国哈尔滨海关、中华人民共和国成都海关。本文件主要起草人:王昱、史梅梅、谭策、杨俊、聂福平、李应国、余华、吴蕊、唐昌杰、谢小倩、张欢。ⅠSN/T5488—2022学兔兔范围本文件规定了猪衣原体病的临床和病理学诊断、病原分离和鉴定(含细胞分离、鸡胚分离、染色观察)和聚合酶链式反应的技术要求。本文件适用猪衣原体病的监测和检疫。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出入境动物检疫采样GB19489实验室生物安全通用要求3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4缩略语下列缩略语适用于本文件。DMEM:杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco’sModifiedEagleMedium);FAM:蓝色羧基荧光素(Carboxy-fluorescein);FITC:异硫氰酸荧光素(Fluoresceinisothiocyanate);PCR:聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction);SPF:无特定病原(Specific-pathogen-free)。5临床诊断5.1临床症状及病理变化5.1.1临床症状猪衣原体病特征症状包括初产母猪突发流产、早产、产死胎或弱仔;适繁母猪群不育空怀;种公猪繁育能力下降;仔猪腹泻、跛行或肺炎症状(见附录A)。5.1.2病理变化猪衣原体病特征病变包括流产胎儿全身皮肤出血,水肿,肝充血、出血和肿大,下颌淋巴结肿胀,间1SN/T5488—2022学兔兔标准下载质性肺炎,关节滑膜炎和回肠末端淋巴结显著增生;种公猪尿道炎、睾丸炎、副睾炎;仔猪肺炎、肠炎、多发性关节炎、脑炎、浆膜炎和结膜炎(见附录B)。5.2结果判定根据特征性临床症状和病理变化可以做出初步预判。进一步确诊应采集样品进行实验室检测。6样品的采集6.1安全要求按照GB/T18088确定采样动物的数量;涉及到病原分离培养的应在生物安全二级实验室中进行,样品的保存和废弃物应按照GB19489要求进行。6.2拭子样品用无菌棉拭子采集鼻腔、眼眶、直肠或生殖道分泌物,放入1mL采样缓冲液的无菌试管中,加冰袋保鲜,于48h内送到实验室。6.3组织样品无菌采集死亡病猪或流产胎儿肺脏、扁桃体、心血、胸水、脑脊液、气管和关节积液等病料适量。用于病原分离的样品浸于足量的采样缓冲液中,加冰袋保鲜或低温冷冻,并于48h内送到实验室;用于切片的组织块应浸于足量的Bouin固定液中,24h内送至实验室。6.4精液无菌采集0.5mL以上的猪精液于离心管中,加冰袋保鲜,于48h内送到实验室。7病原分离和鉴定7.1细胞分离7.1.1试剂和材料敏感细胞(Hella229细胞或McCoy细胞)、胎牛血清(无衣原体抗体)、DMEM培养液、庆大霉素、放线菌酮、链霉素、万古霉素、两性霉素B、庆大霉素、水(符合GB/T6682中一级水的要求)、细胞培养瓶和细胞培养板。常见试剂配制按附录C执行。7.1.2仪器和设备CO2培养箱、Ⅱ级生物安全柜、细胞板离心机(水平转子,3000r/min)。7.1.3操作方法将组织样品按1∶10比例研磨于采样缓冲液中(液体样品除外),室温下500g离心20min取上层清液,用450μmol/L~800μmol/L滤器过滤后接种。对于粪拭子等严重污染样品添加链霉素和万古霉素(25μg/mL~100μg/mL)、两性霉素B和庆大霉素(50μg/mL)预处理(5℃,静置24h)。取适量样品加入Hella229细胞(或McCoy细胞)单层表面,室温2500g离心感作60min(37℃更佳),然后静置于37℃5%CO2下2h,移走接种液,加入含无胎牛血清的DMEM培养液(添加0.5μg/mL放线菌酮和20μg/mL庆大霉素),37℃5%CO2下培养5d~7d。期间收集细胞培养物及其上清液用PCR2SN/T5488—2022学兔兔标准下载(见8.4和8.5)方法鉴定,或将培养物转种到无菌的载玻片上制备细胞爬片,然后进行染色(见7.3)观察。为增加分离成功率可以对接种后6d的阴性细胞培养物盲传2代~3代。7.2鸡胚分离7.2.1试剂和材料6日龄~7日龄SPF鸡胚(要求母体无衣原体感染,血清抗体阴性)、1mL注射器、蛋托、照蛋器。7.2.2仪器和设备CO2培养箱(37℃±1℃)、Ⅱ级生物安全柜。7.2.3操作方法取0.4mL样品接种SPF鸡胚卵黄囊,37℃±1℃孵化4d~13d,剔除72h内死亡鸡胚,收集4d~10d鸡胚卵黄囊进行染色观察(见7.3)或PCR鉴定(见第8章),并按上述方法继续传代3代~4代。7.3染色观察7.3.1试剂姬姆萨染色试剂盒、Bouin固定液、丙酮(分析纯)、甲醇(分析纯)、PBS缓冲液、鼠源抗衣原体脂多糖抗体、FITC标记山羊抗小鼠IgG。7.3.2设备和器材载玻片、盖玻片、普通光学显微镜、组织切片机、Ⅱ级生物安全柜(A型或B型)、荧光倒置显微镜。7.3.3样品制备适合于本法的样品类型包括组织触片、组织切片、细胞爬片或其他细胞单层培养物。整个操作过程应在Ⅱ级生物安全柜内进行,方法如下:———组织触片:将病变组织(如绒毛膜、子叶、胎衣等)或生殖道拭子直接涂抹到载玻片上,然后在室温下干燥15min~20min固定。———组织切片:将病变组织修整为厚度不超过5mm的标本块,浸入Bouin固定液中固定8h~24h,70%乙醇洗涤2遍~3遍,然后用切片机制作切片(厚度≤4μm),室温下干燥15min~20min固定于载玻片上。———细胞单层:制备见7.1.3。7.3.4姬姆萨染色用适量的乙醇冰乙酸(3/1,体积比)固定触片、切片或细胞单层10min~15min,PBS洗涤2次~3次,用姬姆萨染色液染色15min~30min,然后用清水轻柔冲洗表面多余的染液,适当干燥后在油镜下观察。阳性标本片在镜下可见胞浆内疏松排列的包涵体,包涵体内可见许多染成深蓝色或暗紫色的衣原体颗粒(见图B.6。)7.3.5荧光抗体染色用适量的冰甲醇丙酮(1/1,体积比)固定触片、切片或细胞单层,45min后去掉固定液。用PBS缓冲液洗涤2次,每次2min;加入适量鼠源抗衣原体脂多糖抗体,37℃孵育45min,同上述方法洗涤43SN/T5488—2022学兔兔标准下载次;再加入适量FITC标记山羊抗小鼠IgG,37℃孵育45min,同上述方法洗涤4次;50℃烘箱中避光干燥10min,置倒置荧光显微镜下,在蓝色激发光下(490nm)放大200倍~400倍,观察,拍照。阳性样品中的衣原体包涵体颗粒在荧光显微镜下呈现点状或片状黄绿色荧光(见图B.7)。7.3.6结果判定培养产物经姬姆萨染色和荧光抗体染色均为阳性的判为猪衣原体病原分离阳性,否则为阴性。8聚合酶链式反应(PCR)8.1试剂和材料商品化核酸提取试剂盒、Takara1)rTaqPremix(2×)试剂、套式PCR引物(按照D.1执行)、荧光定量PCR引物和探针(按照D.2执行)和TakaraPremixEx-Taq试剂。1)Takara是适合的市售产品的实例。给出这一信息是为了方便本文件使用者,并不表示对这一产品的认可。如果其他产品具有相同的效果,那么可使用这些等效产品。8.2仪器和设备普通PCR仪、琼脂糖电泳仪、凝胶成像仪、荧光定量PCR仪。8.3DNA的提取用采样缓冲液采集的拭子或其他液体样品:涡旋或挤压拭子后,取清液100μL~200μL,室温下1500r/mins离心5min,收集上清(避免取到下层残渣)于另一支离心管中,室温下13000r/min离心30min,弃去上清,加入10μL~15μL无菌双蒸水,溶解沉淀;然后100℃,10min热裂解,4℃保存,24h内用完。组织样品等其他样品可采用商品化核酸提取试剂盒及其相当方法。8.4套式PCR8.4.1第一轮PCR检测第一轮PCR为衣原体属特异性PCR,可以特异性扩增衣原体属的各种衣原体的ompA基因。检测体系包含TakararTaqPremix(2×)12.5μL,上游引物H_up(10μmol/L)0.75μL,下游引物H_low(10μmol/L)0.75μL,DNA3μL~5μL(50ng~500ng),补水至25μL。热循环条件:95℃5min;35个~40个循环:94℃30s,59℃30s,72℃45s;72℃8min。同时做提取对照和阴阳性质控。注:使用反应体系和循环条件的设定可根据不同的PCR试剂而调整,体系的终末引物浓度、Mg2+离子浓度(1.5mmol/L)以及退火温度尽量和上述保持一致。凡有可选范围的参数,应依据实际情况自主选择。8.4.2第二轮PCR检测第二轮PCR为衣原体种特异性PCR,可以特异性检测猪衣原体病相关的衣原体。检测体系包含TakararTaqPremix(2×)12.5μL,通用上游引物H_up_n(10μmol/L)1.0μL,F_low(10μmol/L)0.25μL,第一轮PCR产物0.5μL~1μL,补水至25μL;扩增条件:95℃5min;25个~30个循环:94℃30s,52℃30s,72℃30s,72℃8min。产物用2%琼脂糖电泳分析片段长度。4SN/T5488—2022学兔兔的结果进行结果判定。提取对照和阴性对照应无扩增条带,阳性对照应有特异性条带;若样品的扩增条带长度530bp,将阳性产物应分子克隆测序或直接测序,参考序列按照D.3执行。序列BLAST为猪衣原体的,判为猪衣原体核酸阳性;反之判为阴性。8.5Real-timePCR8.5.1体系配制猪衣原体检测体系:TakaraPremixEx-Taq(2×)10μL,上游引物(10μmol/L)与下游引物(10μmol/L)各0.4μL,探针(10μmol/L)0.4μL,模板1μL~5μL(50ng~500ng),补水至20μL。热循环条件:95℃30s;40个循环:95℃5s、60℃34s,延伸阶段收集荧光(FAM)。同时做提取对照和阴阳性对照。8.5.2质量控制以下条件有一条不满足时,实验视为无效:a)提取对照:无荧光对数增长,相应的Ct值大于40。b)阴性对照:无荧光对数增长,相应的Ct值大于40。c)阳性对照:有荧光对数增长,且荧光通道出现典型的扩增曲线。8.5.3结果判定在符合8.5.2的情况下,扩增曲线呈典型的S型,且Ct值小于30为猪衣原体核酸阳性,Ct值在30~35之间为可疑,大于35为猪衣原体核酸阴性。如结果可疑,应重复一次试验;如再次扩增后Ct值仍为小于40,则判为猪衣原体核酸阳性;如再次扩增后Ct值大于40,则判为猪衣原体核酸阴性。9综合判定9.1动物临床上出现典型的症状或病理变化,且病原分离鉴定或PCR检测为阳性,可判定为猪衣原体病阳性。9.2动物临床上无典型的症状或病理变化,且病原分离鉴定或PCR检测为阳性,可判定为猪衣原体无症状感染。9.3不